Ig/TCR基因重排在兒童急性T淋巴細胞白血病中的表達模式特點

王嬋娟 崔 蕾 李偉京 趙曉曦 高 超 吳敏媛 王天有 李志剛

在兒童急性淋巴細胞白血病(ALL)中，T細胞ALL(T-ALL)占10%～15%，其早期誘導死亡率高，緩解后易復發(fā)，預后明顯較前體B細胞ALL差[1]。定量監(jiān)測微小殘留病(MRD)水平有助于精確評估ALL患兒的復發(fā)風險，指導治療方案和化療強度的調整，實施個體化精準治療[2]。免疫球蛋白(Ig)和T細胞受體(TCR)合稱淋巴細胞抗原識別受體，在干細胞向淋巴細胞分化過程中，Ig/TCR原先分隔的胚系基因片段V、(D)、J發(fā)生重排，所形成的連接區(qū)序列可作為腫瘤特異性的標志來追蹤MRD[3]。Ig/TCR基因重排模式在T-ALL與B前體ALL中不同，T-ALL中MRD水平及其對預后的意義與B前體ALL相比也有一定的差異[4]。本研究采用歐洲BIOMED-2協(xié)作組提出的標準化Ig/TCR基因重排PCR擴增體系[5,6]，對兒童T-ALL初診時抗原受體基因重排進行檢測，以獲取患兒特異性Ig/TCR基因克隆性重排的基因序列信息，為檢測MRD提供理論依據(jù)，并探討了Ig/TCR基因重排情況與患兒臨床特征的關系。

1 方法

1.1 知情同意和倫理 患兒家長在診斷和治療T-ALL時簽署知情同意書。本研究方案通過首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院(我院)倫理委員會審批(審批號：2019-k-99)。

1.2 病例納入標準 ①我院2005年1月1日至2008年12月31日收治的初治T-ALL患兒；②患兒在我院生物樣本庫中有足量臨床檢查剩余的初診骨髓樣本(≥ 1×107個細胞)可行Ig/TCR基因重排及SIL-TAL1融合基因檢測。

1.3 病例排除標準 ①確診T-ALL后未按照既定方案治療者；②入我院前曾在其他醫(yī)院接受化療者。

1.4Ig/TCR基因重排及SIL-TAL1融合基因檢測

1.4.1 骨髓單個核細胞DNA的提取 抽取患兒骨髓2 mL，用紅細胞裂解液(美國BD公司)分離單個核細胞，凍存于-80℃冰箱待用。采用血DNA提取試劑盒(安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)提取基因組DNA。紫外分光光度計檢測提取DNA的質量并進行定量，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 多重PCR方法擴增克隆性Ig/TCR基因重排 采用BIOMED-2協(xié)作組建議的多重PCR體系[6]擴增初診骨髓單個核細胞基因組DNA，篩選克隆性TCRB、TCRG、TCRD和IgH基因重排，設11個平行PCR管(表1)。PCR擴增體系：12.5 μL反應體系，含5×Gold Buffer(英國AB基因公司)2.5 μL，MgCl 21.5 mmol·L-1，上下游引物各2.5 pmol，Taq DNA聚合酶(北京大學第一醫(yī)院卜定方教授惠贈)0.25 U，DNA模板 100 ng。反應條件：95℃預變性7 min， 95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。陰性對照為在我院血液科病房住院的非白血病患兒外周血單個核細胞提取的DNA和水。

1.4.3 PCR擴增產物分析 PCR產物經6%聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色，目的片段處出現(xiàn)單一條帶且邊緣清晰者為單克隆基因重排；2個條帶為雙等位基因或雙克隆基因重排；≥3個條帶考慮為寡克?。粭l帶邊緣模糊者為多克??；無條帶或條帶極弱者為陰性。目的片段大小見表1。

1.4.4 DNA序列測定及連接區(qū)分析 按1.4.2中的PCR擴增體系和條件，反應總體積擴大至50 μL，由上海生工生物工程技術服務有限公司采用ABI PRISM3730型測序儀進行純化測序。將DNA序列輸入IMGT 數(shù)據(jù)庫進行序列比對(http://imgt.cines.fr)，分析白血病患兒的特異性結合部位Ig/TCR重排靶基因序列。

表1 多重PCR方法擴增克隆性Ig/TCR基因重排的類型

1.4.5SIL-TAL1融合基因的檢測 用Trizol試劑(美國Invitrogen 公司)按照說明書提取患兒初診時骨髓樣本中的單個核細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。用逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)將2 μg RNA反轉錄為cDNA。用逆轉錄多重巢式聚合酶鏈反應方法檢測樣本中的白血病特異性融合基因SIL-TAL1，方法和引物參照文獻 [8]。

1.5 T-ALL的治療和早期治療反應評估 我院2005年1月1日至2008年4月1日首次入院的初診T-ALL病例，采用我院BCH-2003 ALL方案治療，2008年4月1日至2008年12月31日收治的初診病例采用中國兒童白血病協(xié)作組CCLG-ALL2008方案治療。T-ALL根據(jù)危險度評估[7]予中?；蚋呶７桨钢委煛?/p>

1.6 隨訪 患兒停藥后每半年至1年來我院隨訪，隨訪內容包括外周血細胞分析和免疫功能檢查。本研究隨訪截止日期為2018年12月31日，根據(jù)門診或住院病歷記錄判斷其是否發(fā)生不良事件(包括復發(fā)、死亡、第二腫瘤)，如無這些不良事件發(fā)生，通過電話隨訪其預后情況。①骨髓復發(fā)：第一次完全緩解后骨髓中原始及幼稚淋巴細胞≥25%。②CNS復發(fā)：初診時無CNS受累或初診時為腦膜白血病而之后腦脊液呈陰性的患兒，在治療過程中腦脊液中原始及幼稚淋巴細胞>5個/μL，或完全緩解后出現(xiàn)顱神經損傷或腦組織受累。③睪丸白血病復發(fā)：完全緩解后組織活檢提示原始或幼稚淋巴細胞浸潤。④聯(lián)合復發(fā)：髓外復發(fā)同時骨髓中原始及幼稚淋巴細胞≥5%。⑤長期緩解標準：患兒停藥后無復發(fā)、死亡、第二腫瘤等事件的發(fā)生。

1.7 資料采集 ①患兒入院時的年齡、性別、初診時WBC、免疫表型、融合基因SIL-TAL1的檢測情況、危險度；②治療方案及早期治療反應；③初診和復發(fā)時的Ig/TCR基因重排檢測結果；④隨訪情況和預后。

1.8 統(tǒng)計學分析 應用SPSS16.0 for windows軟件包(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)進行分析。采用精確概率法χ2檢驗比較陽性組與陰性組在臨床、生物學特征方面及早期治療反應的差異。

2 結果

2.1 一般情況 共52例T-ALL兒童進入本文分析，男37例(71.2%)；入院時中位年齡8.0(1.8～16.0)歲；初診時WBC中位數(shù)140.5(2.7～667.1)×109·L-1。所有病例均經臨床、骨髓形態(tài)、組織化學染色、免疫學、細胞遺傳學、分子生物學確診和分型。

中危38例(73.1%)、高危14例(26.9%)。采用BCH-2003 ALL方案治療40例，采用CCLG-ALL2008方案治療12例。第8 d強的松反應好39例(75.0%)、差13例(25.0%)；第33 d緩解率90.4%(47/52)；第33 d MRD共檢測48例，<10-4為10例(19.2%)、～10-2為23例(44.2%)、 ≥10-2為15例(28.8%)；第78 d MRD 共檢測43例，<10-3為36例(69.2%)、 ≥10-3為7例(13.5%)。

中位隨訪時間為136.3(1.2～171.7)個月，長期完全緩解38例(73.1%)、 復發(fā)10例(19.2%)，其他原因死亡4例(7.7%)。

52例中，SIL-TAL1融合基因陽性14例(26.9%)。

2.2Ig/TCR基因重排在兒童T-ALL中的檢測情況

2.2.1 克隆性Ig/TCR基因重排的發(fā)生率 94%(49/52)兒童T-ALL中TCRB、TCRG、TCRD和IgH4種Ig/TCR基因重排至少檢出1種，3例患兒4種重排均未檢出，88%(46/52)至少檢出2種重排。TCR基因重排中TCRB、TCRG、TCRD基因重排的發(fā)生率分別為85%(44例)、85%(44例)和38%(20例)，其中27例(52%)檢出3種TCR重排，44例(85%)檢出2種TCR重排，5例(10%)檢出1種TCR重排。TCRB和TCRG均陽性42例(81%)；TCRB和TCRD均陽性、TCRG和TCRD均陽性患兒均為16例(31%)。IgH重排跨系表達陽性11例(21%)，91%(10/11)的IgH重排陽性患兒同時為TCRD重排陽性，1例IgH重排陽性的患兒TCRD重排為陰性，P<0.001。

在44例TCRB重排陽性患兒中，61%(26/44)為單克隆，27%(12/44)為雙克隆/雙等位基因重排，12%(5/44)為寡克隆。TCRG重排中，27%(12/44)為單克隆，68%(30/44)為雙克隆/雙等位基因重排，5%(2/44)為寡克隆。TCRD重排中單克隆占70%(14/20)，其余30%為雙克隆/雙等位基因重排。11例IgH重排陽性患兒中82%(9/11)為單克隆，雙克隆/雙等位基因重排和寡克隆各1例。

2.2.2Ig/TCR基因重排類型和胚系片段使用情況 在49例Ig/TCR基因重排陽性患兒中，共檢出180種克隆性基因重排，包括66種TCRB重排、74 種TCRG重排、26種TCRD重排和14種IgH重排，見表2。

表2 Ig/TCR基因重排在兒童T-ALL中的類型和胚系片段情況

66個TCRB克隆中，完全性Vβ-(Dβ)-Jβ重排占62% (41/66)，不完全性Dβ-Jβ重排占38%(25/66)。TCRB完全重排中，共檢出24種Vβ片段， Vβ15、Vβ18、Vβ19、Vβ28和 Vβ7-2都較常見；D片段中Dβ1與Dβ2使用頻率分別為49%和44%，有7%的完全重排未使用Dβ片段。在TCRB不完全重排中，Dβ1、Dβ2分別占52%和48%。不論是TCRB完全重排還是不完全重排，Jβ2都比Jβ1使用頻繁，其中Jβ2.1、Jβ2.3和 Jβ2.7使用均較多(均為15%)，其次為Jβ1. 2(14%)，未發(fā)現(xiàn)Jβ2.4和 Jβ2.6的使用。

在檢出的74個TCRG克隆中，以VγⅠ-Jγ1.3/2.3檢出率最高(69%)，其次為VγⅡ-Jγ1.3/2.3(21%)、VγⅢ-Jγ1.3/2.3(7%)和VγⅠ-Jγ1.1/2.1(3%)。Vγ片段中VγⅠ家族使用最頻繁(72%)，包括Vγ3(22%)、Vγ2(15%)、Vγ5(15%)、Vγ4(12%)、Vγ8(8%)；VγⅡ家族(Vγ9)檢出率為22%；VγⅢ家族(Vγ10)為6%；未檢出VγⅣ家族。

檢出的26個TCRD克隆中以Vδ-Jδ完全重排為主(66%)，其中以Vδ1-Jδ1重排最常見(27%)，檢出少見的Jδ3重排2例。不完全重排Dδ2- Dδ3、Dδ2-Jδ1和Vδ2-Dδ3的發(fā)生率依次為19%、11%和4%。

14種IgH基因重排中包括12個(86%)DH-JH不完全重排和2個(14%)VH-DH-JH完全重排。DH片段使用頻率最多的為DH6-19和DH7-27(均為21%)，還有DH1-1、DH1-7、DH1-20、DH1-26、DH2-21、DH4-4和DH5-18等。JH片段使用頻率依次為JH4(50%)、JH1(21%)、JH3(17%)、JH5 (8%)和JH6(8%)，未檢出JH2。

2.2.3Ig/TCR基因重排的連接區(qū)特點 表3顯示，TCRDVδ-Jδ完全重排連接區(qū)插入的核苷酸數(shù)中位數(shù)為23.0 b p，Vδ3'端和Jδ5'端刪除的核苷酸數(shù)中位數(shù)分別為1.5 bp和1.0 bp；TCRG重排連接區(qū)序列較小，插入核苷酸中位數(shù)為7.0 bp。TCRB完全重排與不完全重排在Dβ-Jβ連接部位核苷酸的插入和刪除數(shù)目相近。IgH的完全性VH-DH-JH重排連接區(qū)插入核苷酸數(shù)(N1區(qū)中位數(shù)10.5 bp和N2區(qū)中位數(shù)14.0 bp)高于不完全DH-JH重排(中位數(shù)9.0 bp)。

2.2.4 初診與復發(fā)時Ig/TCR基因重排模式比較 10例復發(fā)患兒中6例檢測了復發(fā)時的Ig/TCR基因重排模式，4例Ig/TCR基因重排模式(基因重排類型、胚系片段使用情況及連接區(qū)序列)與初診時完全一致，2例改變。1例復發(fā)時TCRD單克隆基因重排消失，TCRB和TCRG基因重排保持不變。另1例復發(fā)時1個TCRBDβ-Jβ不完全重排消失，另1個Vβ-(Dβ)-Jβ和TCRG重排與初診時完全相同。

2.3Ig/TCR基因重排與T-ALL患兒臨床生物學特征的關系 表4顯示，TCRB基因重排陽性和陰性患兒中高危組比例分別為20.5%(9/44)和62.5%(5/8)，P=0.025。TCRB或TCRG基因重排陽性患兒的第33 d緩解率為89.4%(42/44)，陰性患兒為10.6%(5/8)，P=0.022。TCRB或TCRG基因重排陽性患兒第78天MRD水平(≥10-3)為10.8%(4/37)，陰性患兒為50.0%(3/6)，P=0.045。

表3 Ig/TCR基因重排連接區(qū)核苷酸插入、刪除情況(核苷酸中位數(shù)，bp)

表4 兒童T-ALL中Ig/TCR基因重排與臨床生物學特征的相關性(n )

SIL-TAL1融合基因陽性率在11例IgH重排陽性患兒中為0，在41例IgH重排陰性患兒中為34.1%(14/41)，P=0.025。

3 討論

在T細胞分化過程中，TCRD、TCRG基因相繼發(fā)生重排并表達TCRγδ，或接下來發(fā)生TCRB重排和TCRD缺失，TCRA基因重排通常發(fā)生于T細胞發(fā)育晚期，隨后可能出現(xiàn)TCRαβ表達[9,10]。由于胚系基因片段數(shù)量多，連接區(qū)核苷酸的隨機插入與刪除，導致重排后的核苷酸序列極富多樣性。白血病是惡性增殖性克隆性疾病，每個患者體內的白血病細胞都具有各自特異的基因重排序列，這一特定的序列可作為該惡性克隆的分子標志[11]。TCRA的胚系基因片段數(shù)量眾多，且基因重排方式復雜，一般不作為MRD監(jiān)測的標志。此外，Ig家族中的IgH基因重排在T-ALL中存在跨系表達[12]，而IGL和IGK則鮮有報道。因此，本研究選擇TCRB、TCRG、TCRD和IgH基因重排進行檢測。

TCRB基因重排不僅見于TCRαβ+T-ALL中，在多數(shù)TCRγδ+T-ALL中也可發(fā)生。本研究中TCRB基因重排在兒童T-ALL中檢出率為85%，與國外報道(70%～90%)相近，胚系片段使用情況與文獻一致[13]。TCRB連接區(qū)插入和刪除核苷酸數(shù)目變化較大，序列多樣性豐富，加上胚系片段數(shù)量眾多，使得MRD檢測具有較高的敏感度和特異性，90%以上T-ALL中MRD檢測的定量范圍可達到10-4 [14]。因此，TCRB基因重排是T-ALL MRD檢測理想的分子標志。

TCRG基因重排也是T-ALL的主要標志之一，本研究中85%病例有TCRG重排，68%病例檢測到2個TCRG重排，以VγⅠ-Jγ1.3/2.3重排發(fā)生頻率最高(69%)。不同國家的研究對于兒童T-ALL中TCRG重排檢出率為60%～90%，且重排模式也有差異。歐洲和印度的研究顯示TCRG重排中以VγⅠ-Jγ1.3/2.3為主要重排類型(55%～60%)，與本研究相似，而巴西報道則以VγⅡ-Jγ1.3/2.3重排最多見(46%)[15-17]。因而抗原受體基因重排在ALL中的表達模式可能存在種族和地區(qū)的差異。但是由于TCRG胚系基因種類較少，連接區(qū)多樣性有限，導致在定量PCR過程中產生較高的背景擴增，降低了檢測的敏感度。在一些以TCRG為標志進行MRD的研究中，只有67%的T-ALL中定量范圍達到10-4，在前體B-ALL中僅為21%，因而限制了其在MRD檢測中的應用[18]。TCRD基因重排主要發(fā)生于TCRγδ+ALL及未成熟T-ALL中，本研究顯示TCRD以Vδ-Jδ完全重排為主，Vδ-Jδ連接區(qū)序列核苷酸插入數(shù)目較多，因而比較適于MRD的定量檢測。IgH基因重排在T-ALL中以DH-JH不完全重排為主，可以作為TCR重排檢測的有益補充。

本研究還對6例患兒初診和復發(fā)時抗原受體基因重排模式進行比較，大多數(shù)保持穩(wěn)定，無克隆消失，未見新增克隆。在2例患兒中，均各有1個重排消失(分別為TCRD重排和Dβ-Jβ不完全重排)，考慮為該重排所代表的克隆被化療消滅所致，也可能是發(fā)生克隆演化。這2例患兒中的其他2個基因重排均保持不變。因此在MRD檢測中，對于每例患者建議同時檢測至少2個Ig/TCR靶分子，以減少假陰性率[19]。

本研究還對Ig/TCR基因重排與T-ALL患兒臨床生物學特征進行了分析，發(fā)現(xiàn)TCRB或TCRG基因重排陽性患兒的第33 d緩解率高于重排陰性患兒，第78 d MRD水平明顯低于重排陰性患兒，TCRB基因重排陽性患兒中高危組比例明顯低于TCRB陰性患兒。本文發(fā)現(xiàn)IgH重排與SIL-TAL1融合基因相關，SIL-TAL1陽性患兒均未檢出IgH重排；既往本課題組研究發(fā)現(xiàn)，SIL-TAL1陽性T-ALL患兒具有診斷時外周血WBC水平較高、對早期強化治療反應性較差的臨床特點。

一些研究顯示，Ig/TCR重排在ALL中的表達模式存在種族、地區(qū)、年齡、免疫表型和基因型的差異。歐洲BIOMED-2協(xié)作組于2003年提出標準化Ig/TCR基因重排PCR擴增體系，為不同實驗室間的結果比較提供了有利條件。本文采用該體系的PCR 引物擴增Ig/TCR基因重排，絕大多數(shù)(94%)兒童T-ALL中存在至少1種Ig/TCR基因重排，88%的患兒具有兩種重排。每個患兒都具有特異性的連接區(qū)序列，可作為兒童T-ALL治療中監(jiān)測MRD的指標。

綜上所述，T-ALL初診時Ig/TCR基因重排模式特點的分析顯示，克隆性基因重排的胚系片段使用和連接區(qū)序列極具多樣性，分析T-ALL兒童初診時Ig/TCR基因重排的DNA序列信息，有助于進一步行MRD檢測標志物的篩選。