200例原發(fā)性閉經(jīng)患者細(xì)胞遺傳學(xué)分析

李顯箏 許玲 黎鳳珍 蔡嬋慧

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511400)

目前，不孕不育癥對(duì)生育的影響越來(lái)越大，而閉經(jīng)則是引起女性不孕的第6大因素。原發(fā)性閉經(jīng)是指女性年齡超過(guò)14歲、第二性征未發(fā)育、從未有過(guò)月經(jīng)，或年齡超過(guò)16歲、第二性征已發(fā)育，月經(jīng)仍未來(lái)潮，其發(fā)病率約0.1%[1]。大部分原發(fā)性閉經(jīng)患者在未進(jìn)行正規(guī)的遺傳學(xué)評(píng)估的情況下就盲目采取了激素補(bǔ)充治療，而不必要且過(guò)量的激素則帶來(lái)了一系列的臨床問(wèn)題[2]。本文將通過(guò)對(duì)2013 年1月至2017年12月本院就診的200例原發(fā)性閉經(jīng)患者行外周血染色體核型分析，進(jìn)一步了解原發(fā)性閉經(jīng)患者的性染色體異常率及異常核型的種類。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 廣東省婦幼保健院2013年1月至2017年12月因無(wú)月經(jīng)初潮來(lái)本院就診的200例原發(fā)性閉經(jīng)女性患者，臨床表現(xiàn)及社會(huì)性別均為女性表型，且尚未用藥治療。

1.2 方法 簽署知情同意書后，無(wú)菌注射器抽取肝素抗凝外周血3 ml，取0.5 ml接種于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)完成前2 h加濃度為100 μg/ml的秋水仙素25 μl后，繼續(xù)培養(yǎng)12 min，取培養(yǎng)液以1 500 rmp離心6min，棄上清，加入預(yù)溫至37 ℃的低滲液(0.075 mol/L KCl溶液)6 ml，于37 ℃水浴30 min，加2 ml新鮮配制的甲醇、冰醋酸固定液(3∶1)，輕輕混勻，以1 500 rmp離心6 min，棄上清，加入新配固定液約5 ml，離心，按以上方法再固定一次，棄上清，將沉淀調(diào)成細(xì)胞懸液進(jìn)行滴片。60 ℃烤箱烤16h。自然冷卻后，常規(guī)G顯帶，Zeiss染色體核型掃描分析系統(tǒng)掃描，計(jì)數(shù)20個(gè)中期分裂相，分析至少5個(gè)核型；嵌合體病例計(jì)數(shù)至少100個(gè)中期分裂相。染色體多態(tài)性如9號(hào)染色體臂間倒位、著絲粒異染色質(zhì)區(qū)變異、隨體變異等均詳細(xì)描述，并歸入正常染色體核型。按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN2013)的標(biāo)準(zhǔn)命名核型。

2 結(jié)果

200例原發(fā)性閉經(jīng)患者，平均年齡約為20歲，其中檢出50例性染色體異常，異常核型比例25%。其中X染色體數(shù)目異常16例、占8% ；X染色體結(jié)構(gòu)異常8例，占4% ；X染色體數(shù)目伴結(jié)構(gòu)異常15例，占7.5%，含Y染色體11例，占5.5%。(見(jiàn)表1)

表1 200例原發(fā)性閉經(jīng)患者外周血染色體核型分析結(jié)果及臨床表現(xiàn)

3 討論

原發(fā)性閉經(jīng)發(fā)病原因復(fù)雜多樣，約20%～40%的原發(fā)性閉經(jīng)患者存在性染色體異常。本研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性閉經(jīng)患者性染色體的異常率為25%，進(jìn)一步證實(shí)性染色體異常是原發(fā)性閉經(jīng)的重要原因之一。

3.1 X染色體數(shù)目異常與原發(fā)性閉經(jīng) 本研究共檢出核型為45,X 12例，及45,X嵌合型1例。45,X(Turner綜合征)的產(chǎn)生原因主要是在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中X染色體的不分離。Lyon假說(shuō)認(rèn)為：①哺乳動(dòng)物的正常雌性細(xì)胞中，有一條X染色體是處于失活狀態(tài)的；②失活是隨機(jī)的，可能來(lái)自父母任意一方；③失活發(fā)生在胚胎發(fā)育早期，一旦發(fā)生，其子細(xì)胞中將保持恒定失活。X染色體失活可能是45,X能夠存活的一個(gè)重要原因。但是，失活的X染色體上有部分基因是逃逸基因，這些逃逸基因在生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，如位于X染色體的短臂末端區(qū)域的SHOX[3]基因，其劑量上的減少是導(dǎo)致45,X患者身材矮小的主要原因。典型的45,X表現(xiàn)為Turner綜合征，其特點(diǎn)為出生時(shí)低體重，身材矮小，性腺發(fā)育不全，閉經(jīng)，蹼頸，后發(fā)際低，肘外翻等。同單純的45,X相比，45,X嵌合型的患者臨床表現(xiàn)會(huì)有不同程度的減輕，其表型和性腺分化程度取決于分化過(guò)程中體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中45,X與正常細(xì)胞的比例，正常細(xì)胞的比例越高越接近正常人的表型。

3.2 X染色體結(jié)構(gòu)異常與原發(fā)性閉經(jīng) 本研究共檢出X染色體結(jié)構(gòu)異常8例，其中4例為X長(zhǎng)臂等臂染色體，1例X雙著絲粒染色體，3例X染色體與常染色體易位。X染色體失活及逃逸現(xiàn)象，是我們認(rèn)識(shí)涉及X染色體的性發(fā)育異?；颊卟煌R床表現(xiàn)的遺傳理論基礎(chǔ)。根據(jù)Lyon假說(shuō)，當(dāng)X染色體與常染色體發(fā)生易位時(shí)，大多數(shù)情況下是正常的X染色體優(yōu)先失活，從而患者為平衡易位攜帶者，表型上無(wú)異常。而實(shí)際上，本文中的3例X染色體與常染色體易位患者雖然表型上無(wú)明顯異常，但也出現(xiàn)了不同程度的發(fā)育問(wèn)題。究其原因，可能是正常的X染色體失活的位置效應(yīng)，也可能是X染色體斷裂重接處發(fā)生了部分基因的缺失。

3.3 X染色體數(shù)目伴結(jié)構(gòu)異常與原發(fā)性閉經(jīng) 本研究檢出的X染色體數(shù)目伴結(jié)構(gòu)異常病例中，均為異常X染色體與45,X的嵌合體，各自嵌合比例不同導(dǎo)致其表型不同。若45,X核型在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中所占比例較高，則表型更傾向于Turner綜合征的表型。若異常X核型在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中所占比例較高，則因不同區(qū)段承載的基因不同，缺失、易位導(dǎo)致的癥狀也不同。

Wyss等[4]曾繪制了X染色體假定基因位置的模式圖，提示決定性腺發(fā)育的基因位于X染色體的短臂Xp11-Xpter區(qū)域以及長(zhǎng)臂Xq27-q28區(qū)域，而決定軀體正常發(fā)育的基因位于Xp11-Xp12和Xq21-Xq26區(qū)域。而Xql3-Xq27則是卵巢發(fā)育和功能維持的關(guān)鍵區(qū)域[5]，卵巢早衰的相關(guān)致病基因如FMR1、DIAPH、POFlB等均位于該區(qū)域內(nèi)[6]，當(dāng)X染色體與常染色體發(fā)生易位，斷裂點(diǎn)在這兩個(gè)功能區(qū)中時(shí)，可導(dǎo)致卵巢早衰，卵巢體積小或成條索狀。本文中有一例X與16號(hào)染色體易位，其X斷裂點(diǎn)位于Xq13.1，患者出現(xiàn)了卵巢早衰的癥狀。當(dāng)X染色體長(zhǎng)臂缺失，由于斷裂點(diǎn)正好在卵巢關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)，因此患者會(huì)出現(xiàn)原發(fā)閉經(jīng)，卵巢發(fā)育不良，激素水平異常等癥狀，而這些患者由于X短臂未缺失，身高多表現(xiàn)正常[7]。

3.4 46,XY性反轉(zhuǎn)綜合征與原發(fā)性閉經(jīng) 本研究共檢出11例核型為46,XY的女性原發(fā)性閉經(jīng)患者，此類患者屬于性反轉(zhuǎn)綜合征。性反轉(zhuǎn)綜合征主要涉及生殖發(fā)育異常，主要表現(xiàn)為性腺、性別與染色體核型不相符，臨床表現(xiàn)為女性外觀、性腺條索狀、女性幼稚型外陰、陰蒂肥大、陰道短淺且為盲端、第二性征發(fā)育差、出現(xiàn)喉結(jié)等男性體征、睪丸不發(fā)育、兩性畸形等。目前導(dǎo)致該病的原因主要有以下幾種假說(shuō)：①Y染色體上的SRY基因突變或缺失[8]，SRY是男性性別決定基因，位于Y染色體短臂區(qū)域，對(duì)睪丸的形成具有關(guān)鍵作用，因此，SRY基因的突變可導(dǎo)致46,XY女性的形成；②SOX9基因突變[9]：SOX9基因被稱為軀干發(fā)育異常基因，SOX9突變可破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致46,XY個(gè)體的性反轉(zhuǎn)和軀干發(fā)育異常；③其他性別決定相關(guān)基因突變：性別決定和分化是一個(gè)以SRY基因?yàn)橹鲗?dǎo)的、多基因參與的有序協(xié)調(diào)表達(dá)過(guò)程，其中某一基因的突變就可能導(dǎo)致性反轉(zhuǎn)的發(fā)生；④患者存在未檢出的46,XX/46,XY嵌合體：因目前染色體核型分析多采用靜脈血，難以發(fā)現(xiàn)內(nèi)、外、中胚層間的嵌合體，若性腺組織中存在46,XX/46,XY真性嵌合體，其生殖腺發(fā)育則會(huì)出現(xiàn)兩性畸形。目前認(rèn)為SRY基因的突變和缺失是導(dǎo)致46,XY女性性反轉(zhuǎn)的主要原因。

同時(shí)，有學(xué)者認(rèn)為攜帶Y染色體或其來(lái)源序列的女性患者，其發(fā)生性腺母細(xì)胞瘤和無(wú)性細(xì)胞瘤的風(fēng)險(xiǎn)約為30%～75%，因此該類患者需定期檢查，一旦發(fā)現(xiàn)患病應(yīng)及時(shí)手術(shù)治療[10]。

3.5 染色體微小缺失、重復(fù)與原發(fā)性閉經(jīng) 本研究中的200例原發(fā)性閉經(jīng)患者，核型為46,XX 的患者有150例，占受檢總數(shù)的75%。染色體核型雖然正常，但染色體上可能存在某種微小的缺失、重復(fù)或易位，或者某個(gè)基因的缺陷，有待在分子水平上進(jìn)一步研究。國(guó)外有學(xué)者用比較基因組雜交技術(shù)對(duì)染色體核型正常的卵巢早衰患者進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有部分患者存在性染色體微缺失[11]。因此，對(duì)于染色體核型正常的原發(fā)性閉經(jīng)患者，有必要進(jìn)一步行比較基因組雜交檢測(cè)，以排除染色體微缺失、微重復(fù)的可能性。

綜上所述，性染色體異常是導(dǎo)致原發(fā)性閉經(jīng)的主要原因之一。對(duì)于該類患者應(yīng)及時(shí)行細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)，通過(guò)染色體核型分析鑒定，對(duì)核型正常但表型異常的患者需進(jìn)一步采用比較基因組雜交等分子水平檢測(cè)，以排除微小缺失、重復(fù)等。盡量做到早發(fā)現(xiàn)早治療，從而降低生殖腺惡變，減少患者的心理負(fù)擔(dān)，提高患者的生活質(zhì)量。