452例無創(chuàng)產(chǎn)前檢測高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的產(chǎn)前診斷結(jié)果分析

路興軍 李曉東 張勝利 陶華娟 吉龍龍

(濰坊市婦幼保健院 遺傳科，山東 濰坊 261011)

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal testing, NIPT)是通過對母體外周血中的游離DNA進(jìn)行高通量測序，檢測胎兒染色體數(shù)目異常的一種非侵入性產(chǎn)前篩查技術(shù)。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，利用NIPT技術(shù)篩查胎兒常見染色體非整倍體異常，極大地提高了染色體疾病產(chǎn)前篩查的靈敏度和特異度，降低了侵入性產(chǎn)前診斷率[1,2]。有大規(guī)模隨機(jī)對照研究表明，如果侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)是基于NIPT的結(jié)果，那么約98%的有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷是可以避免的[3]。目前NIPT主要針對的目標(biāo)疾病是21-三體、18-三體和13-三體，檢出率分別超過了99%、97%和90%[4]。從原理上看，基于血漿游離DNA全基因組測序的NIPT還可發(fā)現(xiàn)其他染色體非整倍體，因此目前許多實(shí)驗(yàn)室已將NIPT逐步拓展全部染色體的檢測，但成果有限，結(jié)論不一[5]。性染色體非整倍體(sex chromosome aneuploidy, SCA)是一種常見的染色體非整倍體異常，胎兒期的發(fā)生率高達(dá)1/435，常見類型有性染色體單體(45,X)、性染色體三體(47,XXX、47,XXY、47,XYY)及嵌合型性染色體異常[6]，對于SCA的產(chǎn)前篩查目前尚無有效手段。本研究通過對452例NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦進(jìn)一步行羊膜腔穿刺后核型分析，分析NIPT篩查21、18、13-三體和SCA的陽性預(yù)測值(positive predictive value, PPV)，并評估NIPT對SCA胎兒檢出的臨床價(jià)值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2016年1月1日至2017年12月31日于濰坊市婦幼保健院就診，NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)孕婦452例，其中450例接受侵入性產(chǎn)前診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)包括雙胎、多胎妊娠，夫妻之一存在明確的染色體異常，1年以內(nèi)接受過異體輸血、移植手術(shù)、干細(xì)胞治療、免疫治療。所有孕婦均簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法 ①NIPT：孕12～22+6周抽取孕婦外周血5 ml，分離血漿游離DNA進(jìn)行文庫制備，在BGISEQ500測序平臺(武漢華大基因科技有限公司)上進(jìn)行全基因組高通量測序。將NIPT測序數(shù)據(jù)與人類基因組參考序列(HG 19, NCBI build 36)進(jìn)行比對。②侵入性產(chǎn)前診斷：NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)孕婦經(jīng)產(chǎn)前遺傳咨詢，于孕18～22+6周行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水20 ml經(jīng)培養(yǎng)、制片、顯帶后用Leica染色體分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照保存并閱片，每例標(biāo)本計(jì)數(shù)20個分裂象，分析5個完整核型。參照人類遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2013)對染色體核型命名。③外周血染色體核型分析：對所有NIPT提示SCA高風(fēng)險(xiǎn)的病例，在行侵入性產(chǎn)前診斷的同時(shí)行孕婦本人外周血染色體核型分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以(x±s)表示；計(jì)數(shù)資料以率表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NIPT提示21、18、13-三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的產(chǎn)前診斷結(jié)果 NIPT提示21、18、13-三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦共363例，其中21-三體高風(fēng)險(xiǎn)285例，18-三體高風(fēng)險(xiǎn)60例，13-三體高風(fēng)險(xiǎn)18例。經(jīng)羊水細(xì)胞染色體核型分析證實(shí)，285例21-三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中259例與NIPT結(jié)果一致，26例核型結(jié)果正常，為假陽性，NIPT對21-三體的 PPV為90.88%；44例18-三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦羊水核型分析結(jié)果與NIPT一致，16例為假陽性，NIPT對18-三體的PPV為73.33%；13-三體高風(fēng)險(xiǎn)18例，5例經(jīng)羊水細(xì)胞核型分析確診一致，NIPT對13-三體的PPV為27.78%。見表1。

表1 NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦產(chǎn)前診斷結(jié)果

2.2 NIPT提示性染色體非整倍體孕婦產(chǎn)前診斷結(jié)果 NIPT提示SCA共89例，其中性染色體數(shù)目偏多36例，性染色體數(shù)目偏少25例，性染色體數(shù)目異常28例；除2例孕婦拒絕行侵入性產(chǎn)前診斷外，余87例均接受了侵入性產(chǎn)前診斷，經(jīng)羊水細(xì)胞核型分析證實(shí)56例為SCA，其中47,XXY 25例，47,XXX 14例, 47,XYY 4例，嵌合體13例，假陽性31例，假陽性率為35.63%(31/87)。NIPT對性染色體三體的PPV為82.86%，對性染色體單體的PPV低于前者，為37.50%，兩者間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。見表2。

表2 NIPT提示性染色體非整倍體孕婦產(chǎn)前診斷結(jié)果

注：*各有1例拒絕行侵入性產(chǎn)前診斷

2.3 NIPT提示SCA孕婦外周血染色體核型分析結(jié)果 NIPT提示SCA共89例，88例孕婦接受本人外周血染色體核型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12例染色體核型分析結(jié)果異常，其中嵌合型Turner綜合征5例，47,XXX 3例，46,XX,inv(9) 2例，46,X,del(X)(q21.1q22.3)1例，46,XX,t(11;22)(q23;q11.2) 1例，總異常率為13.63%，胎兒染色體核型分析均未見異常。見表3.

表3 NIPT提示SCA孕婦染色體核型分析異常結(jié)果

注：*1例孕婦未行產(chǎn)前診斷，僅行孕婦本人外周血染色體檢查

3 討論

1997年Lo等[7]首次發(fā)現(xiàn)孕婦外周血漿中存在胎兒游離DNA，隨后基于游離DNA高通量測序的NIPT迅速發(fā)展，并在臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)，是目前準(zhǔn)確性最高的非整倍體產(chǎn)前篩查手段[8]，對于常見的染色體非整倍體疾病21-三體、18-三體和13-三體檢測的敏感度可達(dá)98%，特異度超過99%[9]。NIPT對于21-三體、18-三體和13-三體檢測效率較高，成為目前產(chǎn)前篩查的熱點(diǎn)[10,11]。然而NIPT對于胎兒SCA檢出的臨床價(jià)值如何，NIPT是否應(yīng)該將SCA作為目標(biāo)檢測疾病尚存在廣泛爭議[12,13]。

盡管多項(xiàng)研究已證實(shí)NIPT在產(chǎn)前篩查常見染色體非整倍體中具有良好的臨床有效性，但也存在假陽性、假陰性的可能。Cheung等[4]研究表明，NIPT的假陽性率相當(dāng)高，其中對于21、18、13-三體的PPV分別為91%、77%和54%。本研究通過對363例這3種染色體疾病NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn)，NIPT對于21-三體、18-三體和13-三體的PPV分別為90.88%、73.33%和27.78%，略低于Cheung等的研究報(bào)道，可能與本研究NIPT高風(fēng)險(xiǎn)病例來自于不同檢測機(jī)構(gòu)，其診斷標(biāo)準(zhǔn)、測序深度不一有關(guān)。由于NIPT并非直接檢測胎兒的遺傳物質(zhì)，因此存在假陰性及假陽性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)[14]，本研究中假陽性病例較多，尤其是13-三體假陽性率高達(dá)72.22%，Benn等[15]亦發(fā)現(xiàn)NIPT對13-三體的檢測效能較低，認(rèn)為與13號染色體的鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸和胞嘧啶脫氧核糖核苷酸含量較低導(dǎo)致測序時(shí)產(chǎn)生偏差有關(guān)。此外，孕21-三體胎兒的母體血漿中胎兒游離DNA的含量會升高，而孕13-三體胎兒母體血漿中并不出現(xiàn)這種現(xiàn)象，這也降低了對其風(fēng)險(xiǎn)評估的準(zhǔn)確性。因此，盡管NIPT的靈敏性和特異性較高，但不能替代確認(rèn)性的胎兒染色體核型分析，NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦必須經(jīng)過產(chǎn)前診斷進(jìn)一步確診。

SCA胎兒與常見的染色體非整倍體(21-三體、18-三體及13-三體)不同，表型多較輕微，孕期超聲多無異常表現(xiàn)，可存活至出生或不影響壽命，但可有第二性征發(fā)育不良、身高發(fā)育異常和行為異常，是性腺發(fā)育及生育功能異常患者最主要的病因之一，因此對SCA胎兒的檢出更需要安全、可靠的手段。隨著NIPT技術(shù)的不斷發(fā)展，目前不僅可檢測常見的染色體非整倍體異常，而且可提示包括性染色體在內(nèi)的其他染色體非整倍體異常。本研究對87例NIPT懷疑SCA胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，確診56例，復(fù)合PPV為64.37%，假陽性率為35.63%。NIPT對不同類型SCA檢出的PPV不同，對胎兒性染色體三體的PPV為82.86%，對性染色體單體的PPV低于前者，為37.50%。Petersen等[17]在檢測712例樣本時(shí)發(fā)現(xiàn)，NIPT對47,XXY、47,XXX和45,X的PPV分別為87%、50%和26%，與本研究一致。另外，值得注意的是，本研究NIPT提示性染色體數(shù)目偏少的24例胎兒經(jīng)羊水細(xì)胞染色體核型分析，除15例正常胎兒外，其余9例胎兒核型分析結(jié)果均為Turner綜合征的嵌合體型，郭穎等[16]通過對大量研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)，嵌合體是影響產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素之一。因此，專家建議針對NIPT提示所孕胎兒存在性染色體數(shù)目異常時(shí)，應(yīng)在核型分析的同時(shí)進(jìn)行性染色體的熒光原位雜交技術(shù)檢測(fluorescence in situ hybridization, FISH)，以排除性染色體嵌合體的可能。NIPT篩查SCA假陽性率較高，分析其原因包括：①X染色體和Y染色體高度同源不利于分辨；②X染色體鳥嘌呤和胞嘧啶含量偏移；③Y染色體與其他染色體相比，有較多的相似片段，使測序性噪比降低；④母體存在染色體拷貝數(shù)異常、限制性胎盤嵌合；⑤胎兒染色體存在嵌合，或雙胎之一胎死宮內(nèi)，這些因素均可造成分析不準(zhǔn)確，導(dǎo)致假陽性率升高[18,19]。

妊娠母體血漿中的游離DNA包括母體DNA片段和胎兒游離DNA片段，NIPT通過高通量測序直接分析母體血漿中的游離DNA總量，比較受檢個體與正常對照間的染色體測序片段數(shù)，因此母體存在染色體數(shù)目異常時(shí)會導(dǎo)致NIPT陽性。在該研究中，88例NIPT提示SCA的孕婦接受本人外周血染色體核型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12例存在異常核型，其中嵌合型Turner綜合征5例，47,XXX 3例，46,XX,inv(9) 2例，46,X,del(X)(q21.1q22.3)1例，46,XX,t(11;22)(q23;q11.2) 1例，產(chǎn)前診斷胎兒核型均未見異常。Wang等[20]發(fā)現(xiàn)母體性染色體非整倍體尤其是嵌合體在NIPT檢測中可導(dǎo)致假陽性，在該研究中有8例孕婦外周血染色體核型分析存在SCA，其中5例為嵌合體，與Wang等的研究一致。47,XXX女性患者第二性征發(fā)育正常，大都具有生育能力，故目前僅11%的X三體被檢出，該研究發(fā)現(xiàn)的3例47,XXX綜合征孕婦均因NIPT提示性染色體數(shù)目異常而被診斷。其中1例孕婦拒絕行侵入性產(chǎn)前診斷，孕婦準(zhǔn)備再次妊娠時(shí)行外周血染色體核型分析診斷為47,XXX，遺憾的是該孕婦當(dāng)時(shí)因NIPT提示胎兒SCA未經(jīng)產(chǎn)前診斷直接選擇引產(chǎn)，因此，我們再次強(qiáng)調(diào)NIPT的局限性在檢測前及檢測后的咨詢中均應(yīng)謹(jǐn)慎講解，充分告知孕婦NIPT假陽性原因和可能存在的問題，NIPT高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦必須經(jīng)過產(chǎn)前診斷進(jìn)一步確診。

總之，NIPT作為一種安全、快速的產(chǎn)前篩查手段，在篩查常見的21、18、13-三體的同時(shí)能夠篩查出部分SCA患兒，但陽性預(yù)測值偏低，必須進(jìn)一步行侵入性產(chǎn)前診斷確診；對NIPT提示胎兒SCA的孕婦有必要同時(shí)行孕婦本人的外周血染色體核型分析，以排除母體染色體異常。