原生質(zhì)體紫外誘變法選育高產(chǎn)γ-氨基丁酸秀珍菇菌株

張亞青，張 羨，付佳偉，樓 堅(jiān),2,3，劉士旺,2,3

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023)

秀珍菇又名環(huán)柄側(cè)耳、環(huán)柄斗菇、姬平菇和小平菇等，隸屬擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)、傘菌目(Agaricals)、側(cè)耳科(Pleurotaceae)、側(cè)耳屬(Pleurotus)[1-2]。秀珍菇不僅營養(yǎng)豐富，而且味道鮮美，蛋白質(zhì)含量比雙孢蘑菇、香菇、草菇更高，質(zhì)地細(xì)嫩，纖維含量少，口感脆嫩。有資料表明，秀珍菇中含蛋白質(zhì)3.65%～3.88%、粗脂肪1.13%～1.18%、還原糖0.87%～1.80%、糖分23.94%～34.87%、木質(zhì)素2.64%、纖維素12.85%、果膠0.14%等。它的蛋白質(zhì)含量高于香菇、蘑菇，接近于肉類，比一般蔬菜高3～6倍，含有17種以上氨基酸[3]。它富含人體自身不能合成，日常飲食中通常又缺乏的蘇氨酸、賴氨酸、亮氨酸等多種必需氨基酸，長期食用可提高人體免疫功能[4-6]。因此，秀珍菇是一種高蛋白、低脂肪的營養(yǎng)食品[7]，具有獨(dú)特的風(fēng)味和生理功能，符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)對新食品資源開發(fā)“天然、營養(yǎng)、保健”的要求，具有廣闊市場前景，也成為目前食用菌商業(yè)生產(chǎn)中研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

在秀珍菇培養(yǎng)基原料選擇、生產(chǎn)栽培條件控制、栽培模式等研究基礎(chǔ)上，人們對秀珍菇高品質(zhì)菌株研究提出了更高的要求[8-9]，高品質(zhì)高產(chǎn)量秀珍菇選育是眾多秀珍菇研究者特別感興趣的課題之一，但優(yōu)質(zhì)秀珍菇菌株選育方面的研究較少。因此，本文開展了秀珍菇原生質(zhì)體的制備條件和誘變研究，以期為篩選高質(zhì)量高含量γ-氨基丁酸(GABA)秀珍菇菌株及其利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種與試劑

秀珍菇菌種X1：浙江綠滿都菌業(yè)自有生產(chǎn)種；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose ager,PDA)購自杭州百思生物技術(shù)有限公司；蔗糖購自永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司；麥芽浸取物(Malt extract)購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；纖維素酶(R10)購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；溶壁酶(LWZ)購自廣東碧德生物科技有限公司；葡萄糖購自江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；γ-氨基丁酸(GABA)購自阿拉丁試劑有限公司；2,4-二硝基氟苯(FDNB)購自西亞化工有限公司；乙酸、乙酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸氫鈉均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、山梨醇、甘露醇均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9246A)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子天平(TP-114)，德國賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；恒溫水浴鍋(HH-4)，江蘇金壇市儀器廠；pH計(jì)(PB-10)，德國賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；色譜柱sunfireTMC18 5.0 μm 4.6 mm×250 mm column購自美國沃特世科技(上海)有限公司；高效液相色譜儀(UV/Visible detector)，美國沃特世科技(上海)有限公司；高壓滅菌鍋(YXQ-LS-30SII)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；無菌操作臺(SW-CJ-2FD)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫生化培養(yǎng)箱(HWS-250)，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；光照培養(yǎng)箱(BSG-250)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；離心機(jī)(Allegra X-30R Centrifuge)，美國賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及所用溶液配方

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉末43 g，雙蒸水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B10.01 g，雙蒸水1 000 mL，pH值7.2～7.4，121 ℃高壓滅菌15 min。

YMG固體培養(yǎng)基：麥芽浸取物10 g，葡萄糖4 g，酵母抽提物4 g，瓊脂18 g，雙蒸水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。

YMG液體培養(yǎng)基：麥芽浸取物10 g，葡萄糖4 g，酵母抽提物4 g，雙蒸水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。

貯液A：酒石酸銨10 g，磷酸二氫鉀20 g，硫酸鈉5.8 g，磷酸氫二鈉(無水)45 g，雙蒸水定容至500 mL，加入幾滴氯仿室溫保存。

貯液B：硫胺素0.02 g，雙蒸水定容至500 mL，過濾除菌后4 ℃保存。

貯液C：氯化鎂12.5 g，雙蒸水定容至500 mL，121 ℃高壓滅菌15 min，室溫保存。

完全培養(yǎng)基(CM)：葡萄糖10 g，天冬酰胺2 g，腺嘌呤硫酸鹽0.1 g，酵母提取物0.75 g，麥芽提取物1.13 g，酪蛋白胨0.75 g，貯液A 25 mL，貯液B 1 mL，貯液C 10 mL。固體培養(yǎng)基需要另加入15 g瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌15 min。

固體再生培養(yǎng)基：麥芽糖10 g，葡萄糖4 g，酵母抽提物4 g，瓊脂18 g，0.5～1.2 mol/L穩(wěn)滲劑，雙蒸水定容到1 000 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。

穩(wěn)滲劑為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mol/L的蔗糖、山梨醇、氯化鈉、甘露醇，過濾除菌。

0.2 mol/L馬來酸緩沖液：馬來酸4.64 g，雙蒸水定容至200 mL；馬來酸鈉6.4g，雙蒸水定容至200 mL；將上述酸堿溶液以體積比1∶2.5混合，調(diào)節(jié)pH值至5.5，121 ℃高壓滅菌15 min。

MM緩沖液：1.0 mol/L甘露醇25 mL，0.2 mol/L馬來酸鹽緩沖液(pH值5.5)12.5 mL，雙蒸水12.5 mL，過濾除菌。

MMC緩沖液：1.0 mol/L甘露醇25 mL，0.2 mol/L馬來酸鹽緩沖液(pH值5.5)12.5 mL，雙蒸水12.25 mL，氯化鈣(1 mol/L)0.25 mL，過濾除菌。

溶壁酶或(纖維素酶)溶液： 分別稱取0.02、0.03、0.04 g溶壁酶或(纖維素酶)粉末溶于2 mL常溫MM緩沖液中，獲得10、15、20 g/L的酶液，用無菌的0.4 μm的微孔濾膜過濾除菌后放于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?當(dāng)天配制當(dāng)天使用)。

1% FDEB溶液：量取2 mL 2,4-二硝基氟苯置于200 mL乙腈中，保存于棕色試劑瓶中。

出菇物料：麩皮170 g，木屑280 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，氧化鈣2 g，雙蒸水600 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及菌絲體的培養(yǎng)

將4 ℃保藏的X1菌種轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱下靜置培養(yǎng)5 d，待菌落直徑長至9 cm，占培養(yǎng)皿一半左右，且氣生菌絲旺盛時(shí)，即獲得活化秀珍菇菌種。切取綠豆大菌塊，轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基后，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱下靜置培養(yǎng)7 d左右，即可獲得原生質(zhì)體制備所需菌絲體[10]。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備

根據(jù)秀珍菇菌種的生長狀況，選取長勢最好的三角瓶中菌絲體，進(jìn)行下一步原生質(zhì)體的試驗(yàn)[11-13]，離心收集培養(yǎng)好的菌絲體，用滲透壓穩(wěn)定劑MM緩沖液沖洗3次，并移去多余水分。按照每10 mg濕菌絲體加0.4 mL酶液的比例添加酶液到菌絲體管中，輕輕搖勻，在25 ℃和30 ℃下進(jìn)行酶解。每間隔15 min輕輕顛倒數(shù)下使樣品混合均勻，酶解4 h后吸取少量的酶解液進(jìn)行鏡檢，觀察菌絲體的變化并計(jì)數(shù)原生質(zhì)體密度。在觀察4 h之后對比溶壁酶和纖維素酶的酶解效果，統(tǒng)計(jì)并得出最佳酶解溫度以及最佳酶含量。過濾收集酶解液，并于室溫下750 g離心力下離心10 min，收集原生質(zhì)體。分別以MM緩沖液和MMC緩沖液洗滌原生質(zhì)體各2次，最后重懸原生質(zhì)體備用。

1.2.3 原生質(zhì)體的再生

用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋原生質(zhì)體懸液，將密度調(diào)至1×105個(gè)/mL。以每個(gè)皿0.1 mL的量，涂布于固體再生培養(yǎng)基平皿中，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)7 d，統(tǒng)計(jì)菌落再生率。固體再生培養(yǎng)基穩(wěn)滲劑種類分別為蔗糖、山梨醇、氯化鈉、甘露醇，穩(wěn)滲劑摩爾濃度分別為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mol/L。對照處理原生質(zhì)體懸液用無菌水稀釋，并按上述同樣方法涂布于低滲培養(yǎng)基上(固體YMG培養(yǎng)基)，觀察試驗(yàn)組平板和對照組平板的菌落數(shù)。原生質(zhì)體再生率公式如下：

1.2.4 原生質(zhì)體紫外誘變

將1.2.2制備的原生質(zhì)體涂布于穩(wěn)滲培養(yǎng)基上，所選擇的穩(wěn)滲培養(yǎng)基通過1.2.3的試驗(yàn)結(jié)果來進(jìn)行篩選。打開培養(yǎng)皿蓋，為防止染菌，紫外光照由超凈臺提供[14-15]。將培養(yǎng)基放入35 W紫外燈下分別照射15、30、45、60、120 s。光照完畢后立即放入避光霉菌培養(yǎng)箱中，于25 ℃下培養(yǎng)7～10 d直至獲得再生菌落，并統(tǒng)計(jì)致死率[16-17]。

1.2.5 候選突變株長勢對比

經(jīng)過紫外誘變后，選取致死率高的處理?xiàng)l件，隨機(jī)挑取3株再生菌落分別命名為X2、X5、X57，將出發(fā)菌株以及挑選出的菌株轉(zhuǎn)接至YMG固體培養(yǎng)基和CM固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)并觀察長勢。將3株候選突變株及出發(fā)菌株接種至出菇物料瓶中，待菌絲體布滿整個(gè)瓶子時(shí)，將其放入光照培養(yǎng)箱，待其出菇后摘取烘干并磨成粉末備用。

1.2.6 候選突變株GABA含量分析

將3株候選突變株及出發(fā)菌株接種于YMG液體培養(yǎng)基中，18 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。測定液體培養(yǎng)的4株菌株菌絲體的GABA含量。選取在YMG固體培養(yǎng)基上長勢最好的突變株接種于YMG液體培養(yǎng)基中，并將其分成4個(gè)處理組，其中2組加4 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的谷氨酸溶液，分別記為A1、A2，另2組不作處理，分別記為B1、B2。將A1、B1放在18 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將A2、B2放在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間之后，測菌絲體的GABA含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，取GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品6個(gè)，質(zhì)量濃度分別為0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 g/L。準(zhǔn)備纖維素酶液，調(diào)節(jié)pH值到4.0，酶液緩沖液由乙酸鈉和乙酸組成。將試樣中的懸浮物置于80 ℃烘箱下烘2 h左右，烘干后的懸浮物用研缽磨成粉末，稱重，將其放入試管中，每根試管加入10 mL的酶液，45 ℃水浴1 h，沸水浴15 min，冷卻一段時(shí)間后進(jìn)行離心，取上清液5 mL左右。取上清液以及準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)樣品各0.2 mL，分別加入0.2 mL的0.5 mol/L碳酸氫鈉和0.2 mL的1% FDEB溶液，在60 ℃的烘箱下放置1 h進(jìn)行衍生化反應(yīng)，然后加1.4 mL體積分?jǐn)?shù)為0.12%的磷酸溶液避光處理，且每組做3個(gè)平行，其他發(fā)酵液衍生化的處理步驟與此相同[18]。對烘干后的子實(shí)體粉末同樣按照上述方法處理，并測GABA含量，測量方法參考文獻(xiàn)[19]。高壓液相的運(yùn)行參數(shù)，柱子型號為SunfireTMC18，流動相：乙腈/H3PO4水溶液(體積分?jǐn)?shù)為0.12%)為50/50，檢測波長為370 nm，柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 秀珍菇原生質(zhì)體制備結(jié)果

按每10 mg加0.4 mL酶液，分別于25 ℃和30 ℃下進(jìn)行酶解4 h，取酶液統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體密度，結(jié)果見表1。從表1可以看出20 mg/mL溶壁酶(LWZ)所釋放出的原生質(zhì)體數(shù)目最多，其酶解效果較好，同時(shí)30 ℃下原生質(zhì)體得率略高于25 ℃。因此，后續(xù)試驗(yàn)中采用LWZ(20 mg/mL)30 ℃下進(jìn)行再生試驗(yàn)所需原生質(zhì)體制備。

表1 不同水解酶種類和含量下秀珍菇X1原生質(zhì)體密度Table 1 Concentration of protoplast of Pleurotus geesteranus X1 under different hydrolase types and contents

2.2 原生質(zhì)體再生結(jié)果

表2秀珍菇原生質(zhì)體在蔗糖穩(wěn)滲培養(yǎng)基上的再生率統(tǒng)計(jì)

Table2Statistics of regeneration rate of protoplasts fromPleurotusgeesteranuson sucrose steady infiltration medium

蔗糖摩爾濃度/(mol·L-1)再生率/%0.50.24±0.030.60.32±0.090.70.28±0.140.80.15±0.070.90.10±0.051.001.101.20

以蔗糖為試驗(yàn)穩(wěn)滲劑，添加到Y(jié)MG培養(yǎng)基中，涂布原生質(zhì)體后統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體再生率，結(jié)果見表2。從表2可以看出，蔗糖摩爾濃度為0.6 mol/L時(shí)原生質(zhì)體的再生率最高。后續(xù)甘露醇、山梨醇和氯化鈉適宜穩(wěn)滲濃度篩選設(shè)定為0.5～0.8 mol/L。

以甘露醇、氯化鈉、山梨醇為試驗(yàn)穩(wěn)滲劑，添加到Y(jié)MG培養(yǎng)基中，涂布原生質(zhì)體后統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體再生率，結(jié)果見表3。從表3中可以看出甘露醇的最優(yōu)濃度為0.6 mol/L，再生率為0.65%左右,氯化鈉的最優(yōu)濃度為0.5 mol/L，再生率約為0.09%，山梨醇的最優(yōu)濃度為0.6 mol/L，再生率為0.35%左右。故選擇甘露醇0.6 mol/L作為紫外光照的穩(wěn)滲培養(yǎng)基。

表3 秀珍菇原生質(zhì)體在3組穩(wěn)滲培養(yǎng)基上的再生率Table 3 Regeneration rate (%) of protoplasts of Pleurotus geesteranus on three groups of stable osmotic media

2.3 原生質(zhì)體紫外誘變結(jié)果

經(jīng)過梯度時(shí)長紫外光照培養(yǎng)皿后，再生菌落形貌見圖1，致死率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。從圖1可以看出，獲得分離度良好的秀珍菇原生質(zhì)體再生單菌落，再生菌落的長勢較好，菌絲白且致密。從表4可以看出，當(dāng)照射時(shí)長達(dá)到1～2 min時(shí)，致死率達(dá)到76%～86%，屬一般認(rèn)可的正向突變率較高的致死區(qū)間。隨機(jī)挑取3株紫外光照2 min的再生菌落(X2、X5和X57)進(jìn)行后續(xù)性能測試，包括高效液相色譜法測定GABA含量。

圖1 經(jīng)紫外照射后再生菌落的形態(tài)Fig.1 Morphology of regenerated colonies after ultraviolet irradiation

表4不同紫外光照下秀珍菇原生質(zhì)體致死率統(tǒng)計(jì)

Table4Mortality statistics of protoplasts ofPleurotus

geesteranusunder different ultraviolet irradiations

照射時(shí)間/s致死率/%1526.43047.84561.36076.912085.6

2.4 候選秀珍菇突變株長勢對比

秀珍菇菌株X1為出發(fā)菌株，X2、X5和X57為從紫外光照2 min的平板中隨機(jī)挑取的3株候選突變株，3株候選突變株以及出發(fā)菌株在不同培養(yǎng)基上的長勢情況見圖2。從圖2可以看出，在YMG培養(yǎng)基上，突變株X5長勢弱于出發(fā)菌株，X57長勢強(qiáng)于出發(fā)菌株，X2長勢與出發(fā)菌株基本上持平；在CM培養(yǎng)基上，X5長勢強(qiáng)于出發(fā)菌株，X57長勢與出發(fā)菌株基本上持平，X2長勢強(qiáng)于出發(fā)菌株。

圖2 候選突變株在YMG和CM培養(yǎng)基上的長勢對比Fig.2 Comparison of growth potential of candidate mutants on YMG and CM media

圖3 候選突變株子實(shí)體Fig.3 Fruiting bodies of candidate mutants

候選突變株接種至出菇物料后生長出的子實(shí)體見圖3。從圖3可以看出，其子實(shí)體顏色偏白，有微小的傘柄，由于是突變株并且在瓶中培養(yǎng)，存在水分、空氣、光照等因素的影響，形狀與市場上的有一定差異。

2.5 候選突變株GABA含量對比

X1(18 ℃)菌絲粉提取物、X1子實(shí)體提取物及0.9 g/L標(biāo)準(zhǔn)液的出峰圖見圖4。由圖4(c)可知，標(biāo)樣中GABA保留時(shí)間約為5.8 min，從圖4(a)可以看出，在5.8 min左右的時(shí)間X1菌絲粉提取物中有一個(gè)比較小的峰，從圖4(b)可以看出，X1子實(shí)體提取物也有一個(gè)較小的波峰，0.9 g/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)液則是在5.8 min左右有一個(gè)很明顯的峰，其他標(biāo)準(zhǔn)液也是如此，由此可以確定GABA的出峰時(shí)間是在5.8 min。

由標(biāo)準(zhǔn)液求出其標(biāo)準(zhǔn)曲線圖5。取0.2 mL所測液稀釋至2 mL，用圖5所得峰面積-濃度方程計(jì)算出的含量，乘以10倍即為GABA的真實(shí)含量。查閱得知GBAB分子量為103，已知0.2 mL內(nèi)GABA含量，計(jì)算公式為

其中，x為菌菇粉GABA含量，μg/g；m為0.2 mL所測液中GABA質(zhì)量濃度，g/L；n為菌菇粉質(zhì)量，g。

圖4 GABA測定高效液相色譜峰圖Fig.4 The peak diagram of high performance liquid chromatography determined by GABA

圖5 GBAB標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 GBAB standard curve

試驗(yàn)的4株菌株菌絲體的GABA含量見表5，從表5可以看出突變株X2、X5和X57的菌絲體GABA含量均高于出發(fā)菌株X1，提高幅度分別為20.7%、196.3%和126.8%。在向培養(yǎng)基中添加GABA前體(谷氨酸)時(shí)，GABA產(chǎn)量獲得進(jìn)一步提高。X57(18 ℃+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的谷氨酸溶液)與X57(18 ℃)相比，提高幅度為312.37%。在28 ℃下GABA產(chǎn)量提高幅度則要比18 ℃下低得多，這表明溫度條件對GABA累積有一定的影響。

表5 菌絲中GBAB含量檢測表Table 5 Detection table of GBAB content in mycelia

X2、X5、X57等3株突變株子實(shí)體中GABA含量分別達(dá)到(6.32±1.05)、(17.60±2.28)和(10.28±2.16)μg/g。較出發(fā)菌株5.21±0.47 μg/g，3株突變體子實(shí)體中GABA含量分別提高了21.3%、237.8%和97.3%。

3 結(jié) 論

通過此次原生質(zhì)體紫外誘變育種方法進(jìn)行高產(chǎn)γ-氨基丁酸的秀珍菇菌株選育工作的試驗(yàn)，可以得出以下結(jié)論：

1)MM緩沖液中，20 mg/mL的溶壁酶能夠有效去除秀珍菇細(xì)胞壁，獲得密度達(dá)到2×106個(gè)/mL的原生質(zhì)體。

2)秀珍菇X1菌株原生質(zhì)體再生適宜培養(yǎng)基為含有0.5 mol/L甘露醇的YMG培養(yǎng)基，原生質(zhì)體再生率可達(dá)到0.65%±0.13%。

3)秀珍菇X1原生質(zhì)體紫外誘變適宜照射時(shí)間為1～2 min，致死率為76%～86%之間。

4)初步獲得3株突變株，菌絲體和子實(shí)體中，3株突變株GABA含量較出發(fā)菌株分別提高了20.7%、196.3%、126.8%和21.3%、237.8%、97.3%。