慢性心力衰竭兔心室結構重構導致心功能和電生理異常及其意義探討

趙瑤玉 盛 波 趙元剛 楊清喜 陳玉婷 郭瑞強 孫有剛

慢性心力衰竭(心衰)是眾多心血管疾病發(fā)生發(fā)展的終末階段[1]，常出現交感神經調節(jié)失常，心室壁承受機械牽張負荷加重，刺激交感神經系統(tǒng)無序釋放出逃逸和/或超出患者自身調節(jié)的腎素、血管緊張素和醛固酮體液因子于心臟和血液循環(huán)系統(tǒng)，長期作用導致心肌組織纖維化和彌漫性壞死，心室興奮-收縮偶聯喪失，心腔擴大，產生心室結構重構[2]。其結果是心功能下降，心臟不能正常將血液從主動脈泵出供全身需要；心室肌細胞動作電位在傳遞中受阻、出現心室電不均一性，跨室壁離散度增加而誘發(fā)折返性室性心律失常(Ventricular Arrhythmias, VA)和/或異位觸發(fā)性VA[3]。所以，心衰引起心室結構重構造成心室收縮舒張功能下降為VA發(fā)生提供了易損性[4]。只是相關結構重構特征及其引起心功能下降和電生理異常還不完全清楚。本文通過異丙腎上腺素(Isoproterenol, ISO)誘導家兔心衰模型，采用組織病理學及超微切片技術以及超聲心動圖等手段進行檢測分析，旨在為臨床認識和了解心衰發(fā)生結構重構及其引起的VA電生理異常提供實驗依據，為有效防治心衰進一步惡化提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物與分組：本研究遵從武漢大學醫(yī)學院實驗動物管理與使用指南的相關規(guī)定。健康雄性新西蘭大耳白兔購于武漢生物制品研究所，起始體重1.5—2.0kg，共25只。動物購回后飼養(yǎng)于本院實驗動物中心(SPF級動物室)，1—2周后分成對照組(11只)和慢性心力衰竭組(心衰組，14只)。

1.1.2主要儀器和試劑：病理圖像數字分析系統(tǒng)(NIH Image 1.6, 美國)；超薄切片機(LKB-V，Bromma, 瑞士)；透射電子掃描顯微鏡(H-600，日本)；超聲檢測儀(iE33，Philips，美國)；16導電生理記錄系統(tǒng)(PowerLab 16/30，澳大利亞)；電生理記錄和分析模塊(LabChart Pro V7, 澳大利亞)；刺激器(Grass S88，美國)。ISO、戊巴比妥鈉、肝素鈉、甲醛、戊二醛、鋨酸、醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛等分別購于Sigma公司或國內相關試劑公司，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1心衰模型制備：制模方法參考文獻[5]。經兔耳緣靜脈在同一時間段注射ISO(0.3mg/kg/天)，每天1次，連續(xù)不間斷注射3周，注射前后注意剃毛、消毒和止血；對照組注射相同體積0.9%生理鹽水。造模后繼續(xù)喂養(yǎng)6個月，整個飼養(yǎng)過程充分提供動物生活所需要的濕度、溫度和光線，自由進食和飲水。6個月后比較兩組存活兔的臨床表現、M型超聲心動圖和心電圖相關指標，與對照組比較，制模組兔出現消瘦、脫毛、食欲減退、氣促等臨床癥狀；超聲檢測室間隔和心室側壁出現不同程度運動減弱、心腔擴大、射血分數明顯下降；心電圖提示心率減慢， PR和QT間期均延長，ST段下移等改變，提示本實驗兔心衰模型成功[6]。制模組兔有2只在喂養(yǎng)后期出現腹瀉死亡，2只兔在記錄在體電生理指標過程中意外死亡，余10只全部造模成功；對照組兔有1只在開胸時出現氣胸死亡，余10進入后續(xù)實驗。

1.2.2超聲心動圖檢查兔心功能改變：將兩組兔(各10只)背臥捆綁于實驗動物臺上，臺面用溫控電熱毯將兔體溫維持在37°C，備皮、剃除胸部長毛并消毒，待兔安靜后行常規(guī)二維超聲及M型超聲檢查。每次檢查均由同一位熟練的超聲?？漆t(yī)師將超聲探頭(Philips iE33超聲診斷儀，美國Philips公司)貼服于兔胸壁，圖像深度3.0-5.0cm，探頭頻率6MHz。觀察心功能主要指標：左心室射血分數(LVEF)、主動脈最大流速(Avmax)、左心室舒張末期內徑(LVEDd)和室間隔厚度(IVST)。

1.2.3心電圖監(jiān)測兔電生理變化：各組兔在完成1.2.2后，將兔四肢剃毛，待安靜后用電生理儀記錄清醒狀態(tài)下模擬標準肢體II導聯心電圖(Electrocardiogram，ECG ECG-II)，數據采集系統(tǒng)在信號采樣率為1KHz下連續(xù)記錄2h，信號經數模轉換成ECG并存儲計算機，通過電生理儀自帶應用于兔的標準化記錄和分析模塊，測量和分析ECG-II連續(xù)10個P-QRS波群，取各主要參數平均值比較。觀察主要參數：心率、PR間期、QT間期和ST段。

1.2.4ERP和Burst-pacing記錄兔心室電活動離散度和VA誘發(fā)：各組兔耳緣靜脈推注戊巴比妥鈉(300mg/kg)麻醉后開胸，用開瞼器撐開胸廓充分暴露心臟，剪開心包膜，用接觸式雙極鉑金微電極貼于左心室前壁靠近心尖部，記錄心室單相動作電位。利用程控電刺激檢測不同基礎刺激周長(Basic Cycle Lengths, BCL)的心室有效不應期(Effective Refractory Period, ERP)，用鉑金制成刺激雙電極置于右室心外膜，由刺激器發(fā)放刺激對心臟進行起搏，刺激方波均為2ms，刺激強度為2倍舒張閾值，按8∶1的S1S2程控刺激法，即每8個基礎起搏S1后發(fā)出一個期前刺激S2，BCL時的S1S1分別為150ms和200ms， S1S2偶聯間期分別從各自的BCL開始，以5ms步長反掃遞減，直到S2不能誘發(fā)心室激動，此時S1S2偶聯間期定義為心室ERP，即：ERP150和ERP200。記錄心電信號經放大器放大并經濾波器過濾(10Hz-1KHz)后存在計算機中，用自帶的分析軟件進行測量和分析。觀察指標包括BCL為150ms和200ms的ERP150和ERP200及其ERP離散度(dispersion of ERP, dERP)，即dERP150和dERP200。ERP測定完成后采用短陣快速刺激(Burst-pacing)，刺激波寬2ms，BCL從150ms開始，觀察各組兔被誘發(fā)VA，包括室性早搏、室性心動過速或心動顫動，圖形存于計算機，用自帶分析軟件測量和分析誘發(fā)VA的BCL及其誘發(fā)率。

1.2.5組織病理方法檢查兔心室肌組織重構和超微結構變化：將各組完成1.2.4且仍然存活兔手術摘取心臟，置入冰凍生理鹽水中洗凈殘血，立即剪取1cm3左心室組織置于10%中性福爾馬林液中固定，用于免疫組織化學染色；再剪取1mm3左心室組織置于預先冷凍0.1mol磷酸緩沖液+戊二醛中固定，用于超微結構檢查。首先將用于免疫組織化學染色的左心室組織經梯度乙醇系列脫水，常規(guī)石蠟包埋切片(留取第30—32張切片為實驗用切片，厚4μm)，行心臟膠原Masson染色。40×40倍光學顯微鏡下選取切片中血管以外的區(qū)域觀察膠原分布和著色情況，切片中間質膠原纖維被染成藍綠色，利用圖像采集分析系統(tǒng)拍片保存并測定心肌間質膠原面積。心室肌間質膠原纖維定量采用間質膠原容積分數(CVF)表示，即為單位測量面積中膠原所占百分比。將用于超微結果觀察的組織標本在0.1M磷酸緩沖液中漂洗三次，經1%鋨酸固定，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機切片后醋酸雙氧鈾+枸櫞酸鉛染色，最后用透射電鏡觀察心室肌細胞超微結構。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 兩組兔心室肌組織病理學特征比較

與對照組比較，心衰組兔心室肌組織中被染成藍色似條紋狀的膠原纖維明顯增多，膠原纖維之間的心肌細胞排列不規(guī)則，可見心肌纖維斷裂和/或腫脹，并被條狀的結締組織分開。與對照組比較，心衰組兔心室肌組織膠原纖維的CVF顯著增加[(10.03±1.35)% vs (19.82±3.71)%，t=9.74，P<0.01，n=5]。另外，對照組兔心室肌細胞肌絲清晰、寬大厚實、明暗帶清晰，糖原結構清楚、密度高，線粒體帶厚實、緊密嵴，肌小節(jié)排列有序、稠密；心衰組兔心室肌細胞肌絲疏松、明顯延長，充斥著少量排列雜亂線粒體，線粒體腫脹并帶有蓬松嵴、有些出現空泡，肌小節(jié)稀疏增寬、少許斷裂。見圖1。

圖1 對照組與心衰組兔心室肌免疫組織化學(分別為A和C)以及細胞超微結構形態(tài)學(分別為B和D)特征比較

2.2 兩組兔心功能和心電圖檢測主要參數比較

與對照組比較，心衰組兔LVEF和Avmax顯著下降(P<0.05)，LVEDd明顯延長，且IVST明顯變薄(P<0.01)，心率明顯減慢，PR間期和QT間期均顯著延長(P<0.01)，ST段明顯下移(P<0.05)。見表1。

表1 兩組兔心功能和心電圖檢測主要參數比較結果均=10)

注： 與對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 兩組兔心室肌組織ERP和VA誘發(fā)主要參數比較

與對照組比較，心衰組兔ERP150和ERP200均顯著延長，且dERP150和dERP200均明顯增大(P<0.01)，誘發(fā)VA的BCL顯著延長(P<0.01)，VA誘發(fā)率明顯加大(P<0.01)。見表2。

表2 兩組兔心室肌組織ERP和VA誘發(fā)主要參數比較均=10)

注：與對照組比較，1)P<0.01

3 討 論

臨床上慢性心衰大部分源自擴張型心肌病的終末階段，多因體內兒茶酚胺分泌增高日積月累所致，引起心臟結構重構和心功能降低[7]。本實驗結果提示，心衰兔心室肌組織中膠原纖維明顯增多，CVF顯著增加，膠原纖維之間的心肌組織排列不規(guī)則，被條狀的結締組織分開，心肌纖維斷裂，細胞腫脹。顯示心室肌組織及細胞變性，發(fā)生明顯纖維化傾向，出現結構重構，引起心室肌細胞之間相互偶聯程度減少，動作電位依次下傳的阻抗增加，下傳過程受阻，傳導減慢、減弱和/或間斷，跨室壁離散度及電不均一性增加，從而為折返性VA的啟動和維持提供了條件。所以慢性心衰引起的結構重構為折返性VA的誘發(fā)提供了易損性[8]。而從本實驗結果進一步說明慢性心衰的結構重構可能來自心衰兔心室肌細胞肌絲疏松、明顯延長，充斥著少量排列雜亂、腫脹并帶有蓬松嵴和出現空泡的線粒體，肌小節(jié)稀疏增寬、少許斷裂。說明心衰兔心室肌細胞發(fā)生明顯 “去心室肌化”，心室肌細胞失去心肌應有的結構特征異化為膠原纖維。提示慢性心衰發(fā)生結構重構的基礎可能是心室肌細胞超微結構出現退行性改變[9]。

正因慢性心衰發(fā)生了心室結構重構，其引起后果可能是心功能下降與電生理活動異常[10]。本實驗結果提示，慢性心衰兔LVEDd明顯延長，LVEF顯著降低，IVST變薄，Avmax顯著下降。超聲心動圖檢測實驗動物的心臟功能是心血管疾病基礎研究的重要組成部分，本超聲心動圖檢查結果說明心衰兔心臟做功能力明顯不足，心輸出量降低，不能充分泵出心臟血液供應全身。而經心電圖監(jiān)測提示心衰兔心率減慢，PR和QT間期延長，ST段下移均較正常兔明顯。提示心衰兔心電沖動傳導時間延長，心臟為了排出血液供應全身發(fā)生代償性缺血狀態(tài)，這些電活動異常特征為異位起搏點發(fā)放預留了時間和空間，從而使心室電活動的擴布出現異質性，易于誘發(fā)折返性VA[11]。所以，本實驗結果表明，心衰兔心臟經過程控刺激后，有效不應期明顯延長，離散度顯著加大，顯示出心衰時心室電活動的不穩(wěn)定性和離散性，而正是有了這種異常心室電活動，使得心衰兔心室耐受不了快速電刺激，稍微給予一點長周期插入性電刺激就可誘發(fā)VA，甚至危及生命。本實驗結果提示心衰兔心室被誘發(fā)VA的刺激周長明顯延長，VA誘發(fā)率顯著加大。提示慢性心衰的心室在經歷電生理改變，電不均一性增大后對于VA的誘發(fā)具有明顯傾向，誘發(fā)率大大增加[12]?？傊?，慢性心衰兔心室發(fā)生明顯結構重構，使得心功能下降，心室電生理異常改變，二者相互作用，從而易于折返性VA誘發(fā)。通過本實驗探討有利于臨床正常認識和了解慢性心衰病理生理變化及其帶給臨床的嚴重并發(fā)癥，為防治心衰進一步病理性改變，逆轉重構和幸存心室肌細胞回歸提供幫助[13]。