陳夢青,黃丹,2,孫宇,汪帥,李春梅
(1 廣東藥科大學,廣州510006;2 湖南中醫(yī)藥高等??茖W校)
心肌肥厚是心肌梗死、心律失常、心絞痛、心衰等心血管疾病的主要危險因素,但其發(fā)生發(fā)展的機制尚不清楚[1~3]。容積調節(jié)性氯離子通道蛋白3(ClC-3)是電壓門控氯離子通道基因家族成員,在心房和心室細胞中的含量豐富[4]。我們的前期研究[5]顯示,在兒茶酚胺類物質去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)誘導的大鼠心肌細胞心肌肥厚模型中,ClC-3表達顯著降低。本研究觀察了腹腔注射NE及其拮抗劑酚妥拉明(Phentolamine,Phe)對小鼠心肌組織形態(tài)學的影響,并檢測心肌細胞內ClC-3及心肌肥厚標志物心房鈉尿肽(ANF)的表達,以探討NE誘導小鼠心肌肥厚的機制。
1.1 小鼠及主要試劑 C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物合格編號:SCXK(京)2012-0001,飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中。NE、Phe購自美國Sigma公司。TRIzol購自TaKaRa生物公司。PCR引物由生工生物工程有限公司設計并合成,Prime ScriptTMRT Reagent及SYBR PCR Mix購自ToYoBo公司。
1.2 小鼠分組及給藥方法 選取27只六周齡雄性C57BL/6小鼠并隨機分為NE組、Phe+NE組、對照組,每組9只。NE組小鼠每天腹腔注射NE(2 mg/kg);Phe+NE組小鼠每天先腹腔注射Phe(8 mg/kg),2 h后再腹腔注射NE(2 mg/kg)[6,7];對照組小鼠每天腹腔注射等量生理鹽水。
1.3 各組小鼠心臟指數測算及心肌組織形態(tài)學觀察 所有藥物連續(xù)注射7 d后,測算各組小鼠心臟指數并觀察心肌組織形態(tài)學變化。①各組小鼠給藥結束后禁食1 d,記錄其體質量,然后用10%水合氯醛麻醉,用眼科剪及鑷子迅速取出心臟組織,清洗并稱量心臟重量,計算心臟指數。心臟指數=心臟重量/體質量。②取心肌組織,用4%甲醛液固定,制成石蠟切片,60 ℃烘烤2 h,常規(guī)脫蠟,HE染色,脫水,封片,顯微鏡下觀察并拍照。
1.4 各組小鼠心肌組織中ClC-3和ANF mRNA的檢測 取各組小鼠心肌組織,冰上剪碎,用預冷PBS清洗至上清澄清,TRIzol法提取心肌組織總RNA,逆轉錄合成cDNA,以GAPDH為內參,Real-time PCR法檢測心肌組織ClC-3和ANF mRNA的相對表達量。引物序列如下:ClC-3上游引物5′-CCCGAGGTGGAGAGAGACTGCT-3′,下游引物為5′-CCGGCTTTCAGAGAGGTTACG-3′;ANF上游引物為5′- TAGGAGACAGTGACGGACAA-3′,下游引物為5′-GAAGAAGCCCAGGGTGAT-3′; GAPDH上游引物為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA -3′,下游引物為5′-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3′。PCR反應體系:SYBR MIX 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6 μL。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的相對表達量。
1.5 各組小鼠心肌組織中ClC-3蛋白的檢測 采用Western blotting法。取各組小鼠心肌組織,冰上剪碎,用預冷的PBS清洗至上清澄清,按50 mg/mL加入裂解液,冰上勻漿后4 ℃、12 000 r/min離心12 min,取上清,BCA法定量。制備10% SDS-PAG,電泳分離蛋白,電轉移至PVDF膜上,脫脂奶粉封閉2 h,一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h,ECL發(fā)光液浸泡1 min后,以GAPDH為內參,采用凝膠成像系統(tǒng)檢測各組小鼠心肌組織中ClC-3蛋白的相對表達量。ClC-3蛋白的相對表達量=ClC-3蛋白的平均光密度值/GAPDH蛋白的平均光密度值。
2.1 各組小鼠心臟指數比較及心肌組織形態(tài)學變化 ①NE組、Phe+NE組、對照組小鼠心臟指數分別為5.22±0.46、4.80±0.23、4.61±0.25,NE組與Phe+NE組、對照組相比,P均<0.05。②NE組小鼠心肌細胞和心肌肌束排列異常,心肌細胞及細胞核異常肥大、變形,細胞核聚集,出現明顯的心臟重構、心肌細胞增大現象,提示小鼠出現心肌肥厚;Phe+NE組、對照組小鼠心肌細胞正常,心肌細胞排列有序,無核聚集現象,見圖1。
2.2 各組小鼠心肌組織中ClC-3和ANF mRNA的表達比較 NE組、Phe+NE組、對照組小鼠心肌組織中ClC-3 mRNA的相對表達量分別為0.50±0.10、1.16±0.38、1.00±0.00,NE組與Phe+NE組、對照組相比,P均<0.01。NE組、Phe+NE組、對照組小鼠心肌組織中ANF mRNA的相對表達量分別為2.95±1.78、1.96±0.75、1.00±0.00,NE組與Phe+NE組、對照組相比,P均<0.05。
2.3 各組小鼠心肌組織ClC-3蛋白的表達比較 NE組、Phe+NE組、對照組小鼠心肌組織中ClC-3蛋白的相對表達量分別為0.46±0.02、0.68±0.02、0.69±0.04,NE組與Phe+NE組、對照組相比,P均<0.05。
心肌肥厚是威脅人類健康的常見疾病,主要的病理變化表現為心肌重構,包括心臟重量增加、心肌細胞體積增大、心臟成纖維細胞增殖、心間質纖維化和ANF、腦鈉肽、β-肌球蛋白重鏈等心肌肥厚標志物的升高[8]。心肌肥厚的發(fā)生機制十分復雜,人們對心肌肥厚發(fā)生的確切分子機制仍不清楚。研究[9]顯示,誘導心肌肥厚發(fā)生的因素有很多,兒茶酚胺、機械性因素、神經體液、細胞因子、血流動力學等因素都能誘導心肌肥厚的發(fā)生。研究[10]表明,NE刺激可導致大鼠心肌肥厚和纖維化的發(fā)生。NE作為交感神經末梢釋放的重要遞質,可通過α-腎上腺素能受體介導心肌肥厚及ANF的表達升高。本研究發(fā)現,小鼠連續(xù)腹腔注射NE 7 d后心臟指數顯著升高,組織形態(tài)學觀察顯示小鼠出現明顯的心臟重構、心肌細胞增大現象,且心肌肥厚標志物ANF mRNA顯著升高,而NE拮抗劑Phe的加入能明顯改善這一現象。
研究[11]表明,容積調節(jié)性氯離子通道參與了心肌細胞容積調節(jié)和細胞凋亡,對缺血的心肌細胞具有保護作用。ClC-3是容積調節(jié)性氯離子通道基因家族成員之一,在各類動物體內廣泛表達。研究[4]表明,ClC-3可以通過容積調節(jié)性氯離子電流參與細胞容積調節(jié),從而調節(jié)細胞興奮性、細胞遷移、細胞器酸化、細胞的增殖與分化等。Xiong等[12]發(fā)現,特異性敲除小鼠心臟ClC-3基因會誘導心肌肥厚和心力衰竭的發(fā)生發(fā)展,提示ClC-3與心肌肥厚的發(fā)生有一定關系。另外,在擴張型心肌病的犬和主動脈結扎誘導的心肌肥厚小鼠中,均發(fā)現心肌細胞的容積調節(jié)性氯離子電流持續(xù)激活。因此,我們課題組前期進行了細胞研究[5],發(fā)現在NE誘導的大鼠心肌細胞中,ClC-3的表達明顯降低?,F進一步進行動物實驗,結果發(fā)現,連續(xù)注射NE 7 d后,NE組小鼠心肌細胞和心肌肌束排列異常,心肌細胞及細胞核異常肥大、變形,細胞核聚集,出現明顯的心臟重構、心肌細胞增大現象,提示NE可誘導小鼠出現心肌肥厚。進一步檢測發(fā)現,與對照組相比,NE組小鼠心肌組織中ClC-3 mRNA和蛋白的表達均顯著降低,而Phe能拮抗此作用,進一步驗證ClC-3的降低與NE誘導的心肌肥厚有一定的關系。
綜上所述,NE可誘導小鼠心肌肥厚,其機制可能與其抑制ClC-3 mRNA和蛋白的表達有關。