何首烏不同萃取部位對斑馬魚幼魚的肝臟毒性觀察

鄭海洋，楊曉歌，趙崇軍，孫修成，馬志強(qiáng)，李霄

(1 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124，2 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院)

何首烏是蓼科植物何首烏的干燥塊根，主要成分包括二苯乙烯苷、蒽醌、鞣質(zhì)及磷脂，生何首烏具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便的功效，用于瘡癰、瘰疬、風(fēng)疹瘙癢、久瘧體虛、腸燥便秘的治療[1]。制何首烏具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁降脂的功效，臨床上常用于血虛萎黃、眩暈耳鳴、須發(fā)早白、腰膝酸軟、肢體麻木、崩漏帶下和高脂血癥的治療。由于何首烏具有多種功效，在臨床和民間都有廣泛應(yīng)用，近年來發(fā)現(xiàn)由于何首烏導(dǎo)致的肝毒性病例時(shí)有發(fā)生，引起專家和學(xué)者高度重視，有關(guān)何首烏肝毒性的研究也多見報(bào)道。古代藥學(xué)著作《本草匯言》認(rèn)為何首烏有微毒，現(xiàn)代研究[2～4]認(rèn)為其毒性成分可能與蒽醌類成分有關(guān)，也有研究[5～7]表明可能與二苯乙烯苷和鞣質(zhì)有關(guān)。斑馬魚作為一種模式生物，早期胚胎透明，可在顯微鏡下觀察幼魚器官發(fā)育情況，通過對肝臟的表型、卵黃囊吸收情況觀察以及對相關(guān)酶的測定，可以對幼魚的肝臟損傷情況作出快速評價(jià)。2018年1月15日～2018年11月27日，本研究對何首烏不同萃取部位(氯仿部位、乙酸乙酯部位、剩余水相部位)對斑馬魚幼魚的肝臟毒性進(jìn)行觀察，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚、斑馬魚幼魚 AB野生型斑馬魚親本由北京中醫(yī)藥大學(xué)惠贈，養(yǎng)殖及繁殖條件參照Zebrafish Book[8]。繁殖：前1天晚上將斑馬魚按照雌雄魚1∶2的比例放置在繁殖盒內(nèi)，雌雄魚之間用隔板分開；第2天早上將隔板拿掉，接受自然光照，雄魚開始追逐雌魚，到上午10時(shí)左右，產(chǎn)卵受精完畢。將受精卵用滅菌后并加了培養(yǎng)液的凈化水清洗1遍后，轉(zhuǎn)移至直徑15 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，再置于27 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)孵化，期間早晚各換水1次。選取受精后第4天、發(fā)育正常、無畸形的斑馬魚幼魚用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥材、試劑及儀器 生何首烏購自北京同仁堂。二甲基亞砜(DMSO)購自天津市福晨化學(xué)試劑廠，三氯甲烷(氯仿)、乙酸乙酯、無水乙醇、鹽酸、二甲苯購自北京化工廠，甲基纖維素鈉購自國藥集團(tuán)。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總超氧化物歧化酶(T-SOD) 購自南京建成生物工程研究所?？捡R斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒購自北京天根公司。Axio Observer A1熒光倒置顯微鏡購自德國Zeiss公司，DP70熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，酶標(biāo)儀購自美國PerkinElmer公司，Agilent 1200高效液相色譜儀購自美國Agilent公司，電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9052型購自上海一恒科技有限公司，電子天平購自瑞士Precisa公司。

1.3 何首烏不同萃取部位的萃取、制備及后續(xù)實(shí)驗(yàn)中給藥劑量的確定 稱取1 000 g生何首烏，適當(dāng)破碎，用70%乙醇加熱回流提取，每次1.5 h，合并3次提取液，過濾，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮乙醇至無醇味，用氯仿和乙酸乙酯先后萃取提取液至接近無色，得到氯仿、乙酸乙酯萃取部位及剩余水相部位萃取液。將3個(gè)部位萃取液分別濃縮之后，氯仿和乙酸乙酯部位真空減壓干燥，剩余水相部位冷凍干燥，即得何首烏不同萃取部位固體提取物。將斑馬魚幼魚隨機(jī)分配到12孔板中，每孔20尾，采用24 h急性毒性實(shí)驗(yàn)測算何首烏不同萃取部位對斑馬魚幼魚的10%致死劑量(LC10)，據(jù)此確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中何首烏不同萃取部位的給藥劑量，其中氯仿部位的低、中、高給藥劑量分別為3、6、9 μg/mL，乙酸乙酯部位的低、中、高給藥劑量分別為10、20、30 μg/mL，剩余水相部位的低、中、高給藥劑量分別為20、40、60 μg/mL。

1.4 加入高劑量何首烏不同萃取部位后斑馬魚幼魚肝臟表型觀察及肝體比、卵黃囊占比測算 將斑馬魚幼魚隨機(jī)分配到12孔板中，每孔20尾，分別記為a、b、c、d組，其中a組加入高劑量氯仿部位藥液4 mL，b組加入高劑量乙酸乙酯部位藥液4 mL，c組加入高劑量剩余水相部位藥液4 mL，d組加入等量不添加藥物的培養(yǎng)水。各組均置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，用培養(yǎng)水清洗3次除去藥液，將幼魚側(cè)位固定在涂有3%甲基纖維素鈉的載玻片上，在同一光學(xué)條件，顯微鏡下觀察各組斑馬魚幼魚的肝臟表型，使用Image J軟件進(jìn)行圖像處理，計(jì)算斑馬魚幼魚肝體比和卵黃囊占比。肝體比=(肝臟面積/幼魚身體面積)×100%，卵黃囊占比=(卵黃囊面積/幼魚身體面積)×100%。

1.5 加入高劑量何首烏不同萃取部位后斑馬魚幼魚肝臟病理學(xué)觀察 斑馬魚幼魚分組方法同“1.4”。分組后置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，用PBS清洗3次除去藥液，將幼魚置于已滅菌的離心管中，加入4%的多聚甲醛固定24 h，用梯度乙醇作脫水劑逐漸脫去水分，以二甲苯替換出酒精，浸蠟包埋，常規(guī)4 μm切片，脫蠟完成后蘇木精染色5 min，流水沖洗，鹽酸-乙醇分色10 s，自來水中浸泡20 min，再經(jīng)伊紅染色2 min后，脫水、透明、封固，顯微鏡下觀察斑馬魚幼魚肝臟病理學(xué)變化情況。

1.6 加入低、中、高劑量何首烏不同萃取部位后斑馬魚幼魚ALT、AST、T-SOD檢測

1.6.1 加入低、中、高劑量氯仿部位后斑馬魚幼魚ALT、AST、T-SOD檢測 將斑馬魚幼魚隨機(jī)分配到12孔板中，每孔20尾，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，即每組80尾幼魚，設(shè)A1、A2、A3、A4組，其中A1、A2、A3組分別加入低、中、高劑量氯仿部位藥液，每孔4 mL，A4組加入等量不添加藥物的培養(yǎng)水。各組置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，用培養(yǎng)水清洗幼魚3次除去藥液，然后將幼魚轉(zhuǎn)移至稱重并已滅菌的1.5 mL離心管內(nèi)，將離心管置于碎冰之上，賴氏法檢測各組斑馬魚幼魚ALT、AST，羥胺法檢測各組斑馬魚幼魚T-SOD。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6.2 加入低、中、高劑量乙酸乙酯部位后斑馬魚幼魚ALT、AST、T-SOD檢測 選取發(fā)育正常、無畸形、受精4 d的斑馬魚幼魚隨機(jī)分配到12孔板中，每孔20尾，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，即每組80尾幼魚，設(shè)B1、B2、B3、B4組，其中B1、B2、B3組分別加入低、中、高劑量乙酸乙酯部位藥液，每孔4 mL，B4組加入等量不添加藥物的培養(yǎng)水。檢測方法同“1.6.1”。

1.6.3 加入低、中、高劑量剩余水相部位后斑馬魚幼魚ALT、AST、T-SOD檢測 選取發(fā)育正常、無畸形、受精4 d的斑馬魚幼魚隨機(jī)分配到12孔板中，每孔20尾，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，即每組80尾幼魚，設(shè)C1、C2、C3、C4組，其中C1、C2、C3組分別加入低、中、高劑量剩余水相部位藥液，每孔4 mL，C4組加入等量不添加藥物的培養(yǎng)水。檢測方法同“1.6.1”。

2 結(jié)果

2.1 加入高劑量何首烏不同萃取部位后斑馬魚幼魚肝臟表型及肝體比、卵黃囊占比比較 如圖1所示，c、d組斑馬魚幼魚肝臟透明，輪廓明顯，形態(tài)完整，a、b組斑馬魚幼魚肝臟變?yōu)榘祷疑该鞫冉档?，肝臟變大，提示肝臟出現(xiàn)損傷。

a、b、c、d組斑馬魚幼魚肝體比分別為9.631%±0.011%、10.061%±0.014%、8.235%±0.010%、7.785%±0.013%，a、b組與d組相比，P均<0.05；其余組間相比，P均>0.05。

a、b、c、d組斑馬魚幼魚卵黃囊占比分別為3.679%±1.131%、3.648%±1.388%、3.862%±1.345%、3.893%±0.601%，組間相比，P均>0.05，提示沒有出現(xiàn)卵黃囊吸收遲延。

2.2 加入高劑量何首烏不同萃取部位后斑馬魚幼魚肝臟病理學(xué)變化 如圖2所示，與d組相比，a、b組肝細(xì)胞數(shù)量減少，并出現(xiàn)空泡變性及排列不規(guī)則現(xiàn)象，顯示出肝損傷；c組無顯著差異。

2.3 加入低、中、高劑量何首烏不同萃取部位后斑馬魚幼魚ALT、AST、T-SOD水平比較 如表1～3所示，A1、A2、A3組ALT水平均顯著高于A4組(P均<0.05)，B1、B2、B3組ALT水平均顯著高于B4組(P均<0.05)，C2、C3組ALT水平均顯著高于C4組(P均<0.05)。A3組AST水平顯著高于A4組(P<0.05)，B3組AST水平顯著高于B4組(P<0.05)。A3組T-SOD水平顯著高于A4組(P<0.05)，B1、B2、B3組T-SOD水平均顯著高于B4組(P均<0.05)。

表1 加入低、中、高劑量氯仿部位后斑馬魚幼魚ALT、AST、T-SOD水平比較

注：與A4組相比，﹡P<0.05。

表2 加入低、中、高劑量乙酸乙酯部位后斑馬魚幼魚ALT、AST、T-SOD水平比較

注：與B4組相比，﹡P<0.05。

表3 加入低、中、高劑量剩余水相部位后斑馬魚幼魚ALT、AST、T-SOD水平比較

注：與C4組相比，﹡P<0.05。

3 討論

急性毒性實(shí)驗(yàn)是中藥安全性評價(jià)的重要指標(biāo)之一，對闡明藥物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意義[9]。斑馬魚與人類基因具有較高的同源性，基因相似度達(dá)到87%，是理想的藥理毒理模型[10,11]。本研究應(yīng)用斑馬魚為藥理模型，觀察了何首烏不同萃取部位對斑馬魚幼魚的肝臟毒性，為何首烏肝臟毒性的研究提供一定依據(jù)，也驗(yàn)證了斑馬魚模型作為藥物毒性評價(jià)的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入高劑量何首烏氯仿部位、高劑量何首烏乙酸乙酯部位后，斑馬魚幼魚肝臟面積增大，顏色變?yōu)榘祷疑?，肝?xì)胞數(shù)量減少，出現(xiàn)空泡變性及排列不規(guī)則現(xiàn)象，提示出現(xiàn)肝損傷。斑馬魚幼魚發(fā)育早期階段，幼魚口未開，無法對外攝食，此時(shí)卵黃囊作為斑馬魚幼魚的內(nèi)源性物質(zhì)為其發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，肝臟作為幼魚早期發(fā)育的重要器官，如果肝臟受到一定程度的損傷，卵黃囊即會出現(xiàn)一定的吸收延遲，呈現(xiàn)膨大狀態(tài)[12]。本研究中，各組卵黃囊吸收沒有顯著性差異，可能與給藥時(shí)間較短有關(guān)，這還有待進(jìn)一步的研究。

何首烏導(dǎo)致的肝損傷并不是單純的一種機(jī)制導(dǎo)致的。研究[13，14]發(fā)現(xiàn)，給予大鼠口服何首烏水提物后，大鼠肝臟中細(xì)胞色素1A2(CYP1A2)或CYP2E1的活性受到顯著抑制，表明何首烏導(dǎo)致的肝損傷可能與CYP450酶系有關(guān)系。人類肝臟CYP450酶系中至少有9種酶與藥物代謝相關(guān)，而參與外源物質(zhì)代謝的家族主要為CYP1、CYP2、CPY3家族，此3個(gè)家族約占人類肝臟總CYP450量的70%，在藥物代謝過程中起著重要作用[15]。另一方面，Li等[16]研究表明，何首烏導(dǎo)致的肝損傷極有可能屬于特異質(zhì)肝損傷一類，即患者本身存在炎癥或本身對某些藥物過敏等。本研究對各組斑馬魚幼魚的ALT、AST水平進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示，A1、A2、A3組ALT水平均顯著高于A4組，B1、B2、B3組ALT水平均顯著高于B4組，C2、C3組ALT水平均顯著高于C4組；A3組AST水平顯著高于A4組，B3組AST水平顯著高于B4組。綜合ALT和AST指標(biāo)，可見何首烏氯仿部位和乙酸乙酯部位對肝臟損傷嚴(yán)重，提示何首烏肝臟毒性成分存在于這2個(gè)萃取部位中。T-SOD是一種在機(jī)體氧化與抗氧化平衡過程中起著重要作用的酶，其能及時(shí)清除體內(nèi)的超氧陰離子自由基，以保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活性的高低可反映機(jī)體的氧化應(yīng)激水平[17～20]。本研究顯示，B1、B2、B3組T-SOD水平均高于B4組，提示乙酸乙酯部位中的化學(xué)成分破壞了肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激平衡，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，何首烏氯仿部位和乙酸乙酯部位對斑馬魚幼魚具有肝臟毒性，其作用機(jī)制可能是何首烏中的毒性成分通過破壞斑馬魚幼魚肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激平衡，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，為進(jìn)一步研究何首烏肝臟毒性成分提供了依據(jù)。