石榴皮多酚的抗氧化性及其對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

石榴不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且富含多種生物活性物質(zhì)，具有多種防病治病功效[1]，是歷代藥典中的重要中藥，其中多酚類是石榴皮中含量最為豐富的一類活性物質(zhì)[2]。國(guó)內(nèi)外大量研究結(jié)果表明石榴皮多酚在預(yù)防和治療腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病等方面具有明顯效果[3]。當(dāng)今人們?cè)絹?lái)越重視天然植物活性成分對(duì)疾病的預(yù)防和治療，對(duì)石榴皮多酚類物質(zhì)進(jìn)行研究，不僅可以深化人們對(duì)石榴功能價(jià)值的認(rèn)識(shí)，而且可以為石榴合理開(kāi)發(fā)和利用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。本研究采用冷浸過(guò)夜的方法從石榴皮中提取多酚，并采用福林酚比色法測(cè)定其含量，DPPH和ABTS法測(cè)定石榴皮多酚體外抗氧化活性，MTT法測(cè)定石榴皮多酚對(duì)細(xì)胞增殖的影響，為石榴皮的綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

石榴皮：購(gòu)于泰安中藥材市場(chǎng)，經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院孫立彥副教授鑒定為石榴科(Punicaceae)石榴屬植物石榴(PunicagranatumL．)的干燥果皮，符合中國(guó)藥典2015 年版標(biāo)準(zhǔn)。

試劑：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(Sigma)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，新生牛血清(四季青)，胰蛋白酶(Solorbio)，MTT(Solorbio)，吉姆薩染料(北京諾博萊德科技有限公司)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器：CO2培養(yǎng)箱(Themo Fisher)，倒置顯微鏡(XDS-1)，超凈工作臺(tái)，高壓滅菌器(MJ3760D)，電熱鼓風(fēng)干燥箱，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BJ000624)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(752s)。

細(xì)胞株：小鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞(PC12細(xì)胞)，購(gòu)自中國(guó)細(xì)胞庫(kù)典藏細(xì)胞中心，并由本實(shí)驗(yàn)室凍存，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1石榴皮多酚提取物的制備

溶劑萃取法是傳統(tǒng)的提取方法，本實(shí)驗(yàn)用95%的乙醇粗提；然后用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取多次；而后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得石榴皮多酚。本實(shí)驗(yàn)使用的乙醇濃度為95%，料液比為1∶20，提取時(shí)間為48 h。

1.2.2石榴皮中總多酚含量的測(cè)定

1.2.3體外抗氧化活性分析

DPPH·自由基清除率的測(cè)定[4]：將40 mg DPPH自由基溶于500 mL 70%乙醇中，配成0.08 mg/mL的溶液，以抗壞血酸(VC)為陽(yáng)性對(duì)照，在517 nm處測(cè)定各樣品的吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算石榴皮多酚提取液的DPPH自由基清除能力。每個(gè)質(zhì)量濃度組平行測(cè)定3次，取其平均值，測(cè)定結(jié)果以清除率表示。樣品對(duì)DPPH·自由基的清除能力用下式表示：DPPH·清除率=[Ao-(As-Ab)]/Ao×100%，式中：Ao為4.00 mL DPPH自由基溶液+1.00 mL乙醇反應(yīng)的吸光度值；As為4.00 mL DPPH溶液+1.00 mL石榴皮多酚提取液反應(yīng)的吸光度值；Ab為4.00 mL已醇+1.00 mL石榴皮多酚提取液反應(yīng)的吸光度值。

ABTS+自由基的清除作用分析：ABTS+自由基清除法已被廣泛應(yīng)用于生物樣品總抗氧化能力的測(cè)定。用pH 7.4的PBS溶液配制7 mmol/L的ABTS+工作液，與2.5 mM過(guò)硫酸鉀1∶1混合，再用PBS(pH=7.4)稀釋到734 nm下吸光度為0.7，在冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ诜磻?yīng)體系中加入50 μL多酚提取液，再加入3 mL ABTS+工作液，振蕩搖勻，于室溫下避光靜置6 min，測(cè)定溶液在734 nm下的吸光度值。ABTS+清除率=(1-As/Ao)×100%，其中As為樣品管的吸光度值，Ao為對(duì)照管的吸光度值。以樣品濃度對(duì)自由基清除率進(jìn)行線性擬合，并計(jì)算IC50值。其中IC50定義為清除率為50%時(shí)所需抗氧化劑的濃度[5]。

1.2.4石榴皮多酚提取物對(duì)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞增殖的影響

MTT 試驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min，完全培養(yǎng)基重懸、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升6×103個(gè)，每孔100 μL接種至96 孔板。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入20 μL不同濃度的石榴皮多酚提取液，使其終濃度分別為100、80、60、40、20、10 μg/mL，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照組0 μg/mL(即只加細(xì)胞，不加提取液)。每組重復(fù)5次。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h ，取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。然后每孔加入二甲亞砜溶解液100 μL，平板搖床振搖5 min，使結(jié)晶紫顆粒溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)490 nm測(cè)定吸光度值(A490)，計(jì)算生長(zhǎng)存活率：存活率(%)=A試驗(yàn)組/A陰性對(duì)照組×100%。

細(xì)胞形態(tài)觀察：將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種至25 mL 培養(yǎng)瓶中，每瓶4 mL。培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的石榴皮多酚提取物，同時(shí)設(shè)定不加藥的陰性對(duì)照組。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h ，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Sigmaplot 12.5 軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 石榴皮多酚提取物中多酚含量測(cè)定

將石榴皮多酚提取液按前述方法配制好后放置顯色40 min，以相應(yīng)試劑為空白，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，平行測(cè)定3次，對(duì)照沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程得出石榴皮多酚含量。石榴皮提取物中的總多酚含量為其干重的18.40%。

2.2 石榴皮多酚提取液體外抗氧化研究

2.2.1石榴皮多酚提取液自由基清除能力

DPPH·自由基經(jīng)常被用來(lái)作為測(cè)試抗氧化性試劑，通過(guò)對(duì)抗氧化劑樣品直接捕獲或與DPPH·自由基相結(jié)合行為的研究，來(lái)衡量抗氧化劑的清除能力。許多高活性自由基在細(xì)胞新陳代謝中不斷產(chǎn)生，由于其能誘發(fā)細(xì)胞輻射損傷、自身免疫缺陷病以及癌癥等病癥，必須及時(shí)對(duì)其清除，因此尋找天然的抗氧化劑就顯得十分必要。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)迅速、操作簡(jiǎn)單，在食品藥品的抗氧化效果評(píng)價(jià)中應(yīng)用廣泛。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法配制不同濃度的溶液，取上清液在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)其吸光度，根據(jù)公式計(jì)算石榴皮多酚提取液對(duì)DPPH·自由基清除能力，結(jié)果如圖1。

由圖1可知，石榴皮多酚提取液對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力，在較低濃度下已經(jīng)有較高的清除率；隨著多酚濃度的增加，對(duì)自由基的清除率也增強(qiáng)，在1～10 μg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，根據(jù)IC50值顯示，石榴皮多酚提取液半抑制濃度(IC50)為3.64 μg/mL，低于5 μg/mL，強(qiáng)于Vc(IC50=5.38)的DPPH自由基清除活性。

圖1 石榴皮多酚提取物的DPPH自由基清除能力

2.2.2石榴皮多酚提取物的ABTS+自由基清除能力

以抗壞血酸(Vc)作陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定結(jié)果如表1,2和圖2所示，隨濃度的升高，兩者對(duì)ABTS+的清除率均增加。在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，石榴皮多酚提取物濃度與ABTS+清除率之間呈線性關(guān)系。在濃度<10.0 μg /mL 時(shí)，提取物的清除率明顯大于Vc；當(dāng)濃度≥15.0 μg /mL 時(shí)，提取物和Vc 的自由基清除率相差不大，清除率大于70%。且石榴皮多酚提取物IC50值(2.63)比對(duì)照Vc(2.99)小，說(shuō)明石榴皮多酚提取物有較強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力。

2.3 石榴皮多酚提取物對(duì)細(xì)胞影響的分析

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定細(xì)胞吸光度的變化來(lái)測(cè)定細(xì)胞數(shù)量的變化。由圖3可知，PC12細(xì)胞在經(jīng)過(guò)消化傳代后，6天時(shí)間內(nèi)連續(xù)觀察，第1、2天是PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)潛伏期，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；第3、4、5天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在電子顯微鏡下細(xì)胞為多角形貼壁生長(zhǎng)，第5天的時(shí)候基本融合。

2.3.1石榴皮多酚提取物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

將加入石榴皮多酚提取物前后的PC12細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖4，5所示：傳代后約6 h PC12 細(xì)胞貼壁，貼壁后的PC12細(xì)胞爬壁生長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)分布均勻，呈顆粒狀，可見(jiàn)圓形的細(xì)胞核(圖4)。細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，細(xì)胞之間緊密連接，互相連成片。加入石榴皮多酚提取物后，倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，部分細(xì)胞收縮呈類圓形，有大量致密的顆粒物質(zhì)聚集于細(xì)胞膜下，細(xì)胞中部密度顯著降低幾乎觀察不到細(xì)胞核。細(xì)胞貼壁能力下降，細(xì)胞之間的連接減少，細(xì)胞與細(xì)胞之間幾乎不能連接成片而出現(xiàn)空隙，部分提取物作用后出現(xiàn)較多細(xì)胞懸浮現(xiàn)象。

2.3.2石榴皮多酚提取物對(duì)細(xì)胞存活率的影響

惡性腫瘤的生物學(xué)特性之一是細(xì)胞過(guò)度增殖，控制癌細(xì)胞繁殖程度可反映腫瘤的治療效果。為了研究石榴皮多酚對(duì)PC12細(xì)胞是否具有增殖抑制作用，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法測(cè)定石榴皮多酚提取物對(duì)細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如表3和圖6所示：石榴皮多酚提取物作用PC12 細(xì)胞24 h 時(shí)，對(duì)細(xì)胞的抑制率和石榴皮多酚濃度呈正相關(guān)。隨石榴皮多酚濃度增大，對(duì)PC12細(xì)胞抑制率也隨之增大，抑制程度和濃度的關(guān)系可分為3種：0～10 μg/mL抑制率可以忽略，在20～40 μg/mL抑制率差異不大，60～100 μg/mL抑制率明顯增高。從圖6可得：石榴皮多酚對(duì)細(xì)胞的增殖有抑制作用且與石榴皮多酚的濃度有相關(guān)性，隨多酚濃度的升高，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯。

表1 石榴皮多酚提取物的ABTS+自由基清除能力

表2 Vc的ABTS+自由基清除能力

圖2 石榴皮多酚提取物的ABTS+自由基清除能力

圖3 PC12細(xì)胞吸光度與培養(yǎng)天數(shù)的關(guān)系

圖4 加入石榴皮多酚前的PC12細(xì)胞形態(tài)

圖5 加入石榴皮多酚后的PC12細(xì)胞形態(tài)

濃度 (μg/mL)吸光度123平均存活率(%)00.8220.8160.8180.819100 100.8180.8140.8220.818100 200.8060.8080.8040.80698 400.7510.7530.7490.75192 600.7010.7030.6930.69985 800.6190.6150.6260.62076 1000.5010.5120.5180.51062

圖6 不同濃度石榴皮多酚提取物對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

3 討 論

石榴皮多酚提取液對(duì)DPPH·自由基和ABTS+自由基的清除實(shí)驗(yàn)表明，石榴皮多酚提取物具有較強(qiáng)的清除自由基能力，可作為天然抗氧化劑清除體內(nèi)正常代謝所產(chǎn)生的羥自由基、超氧陰離子等活性氧自由基，避免自由基失衡誘發(fā)機(jī)體的快速衰老和惡性腫瘤，為石榴多酚的綜合應(yīng)用提供理論依據(jù)。但是其抗氧化活性的具體機(jī)理，還需對(duì)各組分分離后進(jìn)行進(jìn)一步生物學(xué)研究。

石榴皮多酚提取物對(duì)PC12細(xì)胞的增殖有抑制作用且與石榴皮多酚的濃度有相關(guān)性，隨多酚濃度的升高，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯。石榴皮多酚在體外可誘導(dǎo)PC12凋亡，具有較好的抗腫瘤活性，但其抗腫瘤作用機(jī)制還需進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)和相對(duì)應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化有關(guān)。