利用泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域UBAN探針鑒定線性泛素化底物

司 甜，杜現(xiàn)禮，劉 峰，段小濤

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

泛素（ubiquitin）是一個(gè)含有76 個(gè)氨基酸的小分子蛋白，廣泛存在于真核生物體內(nèi)且序列高度保守。泛素化（ubiquitination）修飾由多個(gè)泛素鏈連于底物蛋白上形成，是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在真核細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用。在泛素激活酶（ubiquitin activating enzyme，E1）、泛素綴合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）和泛素連接酶（ubiquitin ligase，E3）的作用下，泛素分子發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，使泛素蛋白連接到相應(yīng)底物上。其具體作用方式如下：在ATP供能的情況下，E1酶司職激活泛素分子的賴氨酸殘基，將其轉(zhuǎn)移到E2 酶上，E2 酶攜帶激活的泛素轉(zhuǎn)交給E3 酶，E3 酶識(shí)別底物，并將泛素分子連接到底物上，使底物發(fā)生泛素化修飾。目前，已知在人類基因組中存在2種E1酶，數(shù)十種E2 酶，1000 多種E3 酶和100 多種去泛素化酶。每種E2酶都可匹配多種E3酶，而E3酶具有與底物結(jié)合的選擇特異性，該特異性決定了E3酶在泛素化進(jìn)程中至關(guān)重要的作用。

泛素分子主要有8 種不同類型的連接方式，其中7種涉及泛素分子C端的甘氨酸G與泛素鏈內(nèi)部賴氨酸K 相連接的方式，包括K6，K11，K27，K29，K33，K48 和K63 位 的多聚泛素化修 飾。K11 和K48的泛素連接方式在蛋白降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用。K63類型的泛素化修飾參與了一系列重要的生物學(xué)過(guò)程，包括DNA損傷修復(fù)、先天免疫及蛋白膜轉(zhuǎn)運(yùn)等［1-3］。自2006年線性泛素鏈組裝復(fù)合體（linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC）被發(fā)現(xiàn)以來(lái)［4］，對(duì)由泛素N 端甲硫氨酸的氨基基團(tuán)與另一泛素甘氨酸Gly76的羧基基團(tuán)相連形成的第8種連接方式的研究逐步展開(kāi)。該復(fù)合體由血紅素氧化鐵調(diào)節(jié)蛋白的泛素連接酶1 長(zhǎng)變體（longer isoform of haem-oxidized iron-regulatory protein ubiquitin ligase 1，HOIL-1）相互作用蛋白（HOIL-1-interacting protein，HOIP），HOIL-1和SHANK 相關(guān)RH 結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白（Shank associated RH domain interacting，SHARPIN）組成。初步研究發(fā)現(xiàn)，在先天性免疫和抑制炎癥反應(yīng)等過(guò)程中，這種頭尾相連的泛素化修飾發(fā)揮著重要作用。由于線性泛素化特殊的連接方式和極低的豐度使其相關(guān)蛋白底物的鑒定異常困難。目前已報(bào)道的LUBAC復(fù)合體底物僅有NF-kB必需調(diào)節(jié)蛋白（NF-kB essential modulator，NEMO）［5］，ISG15連接酶（ISG15 ligase）TRIM25［6］，受體互作絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2（receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2，RIPK2）［7］，含CARD凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）［8］，F(xiàn)as 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（Fas associated via death domain，F(xiàn)ADD）［9］，RIPK1［10］及CASP8 和FADD 樣凋亡調(diào)節(jié)蛋白（CASP8 and FADD like apoptosis regulator，c-FLIP）［11］，更多的線性泛素化底物及生物學(xué)功能尚待進(jìn)一步探索。因此，系統(tǒng)篩選和鑒定線性泛素化底物對(duì)于充分理解線性泛素化的生物學(xué)功能具有重要意義。

目前，針對(duì)泛素化底物的富集策略主要包括：在肽段水平針對(duì)泛素殘基的特異性抗體免疫純化法、標(biāo)簽富集法以及在蛋白水平基于泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ubiquitin-binding domains，UBD）的親和純化方法。對(duì)于抗體富集法，特異性針對(duì)線性泛素化的抗體多數(shù)不適用于免疫共沉淀富集底物而只適用于潛在線性泛素化底物的確認(rèn)［12］；對(duì)于標(biāo)簽富集法，由于泛素鏈連接方式特殊，在泛素分子N 和（或）C端加上標(biāo)簽?zāi)苡绊懛核氐木€性連接［13］。鑒于此，在接近生理?xiàng)l件下建立高效富集線性泛素化的底物的方法就顯得尤為重要。本研究利用UBAN 結(jié)構(gòu)域構(gòu)建線性泛素化底物探針［14］，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)捕捉和富集線性泛素化修飾的底物，極大地豐富了線性泛素化底物鑒定領(lǐng)域的研究方法，并為進(jìn)一步探索線性泛素鏈的更多生物學(xué)功能提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

HeLa 細(xì)胞和293T 細(xì)胞來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)；大腸桿菌DH5-α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自博邁德有限公司。帶有GST 標(biāo)簽的M1-SUB 質(zhì)粒及pGEX-6P1-GST-空載體質(zhì)粒來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室，其中M1-SUB質(zhì)粒載體為pGEX-6P1，其UBAN 結(jié)構(gòu)域拷貝自NEMO 的第257～346 殘基。5×上樣緩沖液購(gòu)自北京鼎國(guó)科技有限公司；GST 瓊脂糖微珠購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare 公司；Western 蛋白印跡法所用蘇氨酸288位磷酸化兔抗人極光激酶A（Aurora kinase A，Aurora-A）單克隆抗體、兔抗人Aurora-A 單克隆抗體、兔抗人NEMO多克隆抗體及小鼠抗人微管蛋白（tubulin）多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；線性泛素化抗體由Vishva Dixit博士實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；顯影試劑購(gòu)自美國(guó)威哥拉斯公司；HOIP，HOIL-1 和SHARPIN 基因干涉序列購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，貨號(hào)分別為HSS123836，HSS145705和HSS149631。恒溫金屬浴購(gòu)自金銀杏生物科技有限公司；Western蛋白印跡電泳槽和電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；細(xì)胞孵箱購(gòu)自日本SANYO公司；常溫臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；低溫臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendor 公司；細(xì)胞操作臺(tái)購(gòu)自美國(guó)Airtech公司；Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 M1-SUB探針制備

把UBAN 連接至大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-6P1-GST，利用大腸桿菌純化體系對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)純化，純化出帶有GST標(biāo)簽的特異性識(shí)別線性泛素鏈的蛋白，稱為GST-UBAN蛋白；利用GST標(biāo)簽與GST瓊脂糖微珠的親和性將該GST-UBAN蛋白與GST 瓊脂糖微珠連接制成探針，即M1-SUB 探針。利用大腸桿菌純化體系對(duì)pGEX-6P1-GST 載體表達(dá)純化，純化出GST標(biāo)簽；將GST標(biāo)簽與GST瓊脂糖微珠連接制成GST-空載體，即對(duì)照探針。具體步驟如下：①菌種活化：將1 mL 菌液接種于100 mL LB 培養(yǎng)基中，30℃，200 rpm 振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，取1 mL 菌液于600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A600nm）值約0.5 時(shí)，即為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；②加入誘導(dǎo)劑IPTG 至終濃度0.2 mmol·L-1，18℃，180 rpm 振蕩誘導(dǎo)過(guò)夜；③用50 mL離心管4℃，5 000×g離心5 min收集菌體；④在菌體中加入A液（0.4%NP-40、Tris-HCl pH7.9 40 mmol·L-1、40%丙三醇、EDTA 2 mmol·L-1、MgCl2 1 mmol·L-1、苯扎嘧啶0.3 mol·L-1、PMSF 0.2 mol·L-1、DTT 1 mol·L-1和溶菌酶200 g·L-1）10 mL重懸；⑤冰浴超聲破碎細(xì)胞，頻率約7。超聲2～3 s 停2～3 s，15～20 次1 個(gè)循環(huán)，至菌液清亮；⑥收集菌體裂解液至50 mL離心管中，4℃，11 000×g離心10 min，取上清置另一50 mL 離心管中；⑦平衡GST瓊脂糖微珠：把GST瓊脂糖微珠80～100 μL加入到1 mL A 液，4℃混懸2～3 min 后4℃，600×g離心5 min，棄上清，重復(fù)3 次；⑧把平衡好的GST瓊脂糖微珠加入菌體裂解液上清中，4℃旋轉(zhuǎn)約4 h使GST-UBAN 蛋白或者GST 標(biāo)簽結(jié)合至GST 瓊脂糖微珠上；⑨通過(guò)4℃，600×g離心10 min 棄上清，收集混合在菌體裂解液上清中的GST瓊脂糖微珠；⑩用A 液1 mL 洗滌GST瓊脂糖微珠以去除非特異性結(jié)合的蛋白，4℃旋轉(zhuǎn)10 min 后4℃，600×g離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌3 次，即制備獲得M1-SUB 探針或?qū)φ仗结槪缓笥谠搩商结樦蟹謩e加入A液100 μL，4℃保存。

1.3 M1-SUB探針中GST-UBAN蛋白含量測(cè)定

用SDS-PAGE 電泳分離和考馬斯亮藍(lán)染色測(cè)定M1-SUB 探針中UBAN-GST 蛋白的含量。同時(shí)利用梯度稀釋法，用蒸餾水把BSA 標(biāo)準(zhǔn)品配制為0.5，1.0，4.0，8.0 和12.0 g·L-1，每濃度取10 μL 上樣，作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4 M1-SUB探針功能驗(yàn)證

以已知底物NEMO為陽(yáng)性對(duì)照，將M1-SUB探針與293T 細(xì)胞裂解液共孵育，免疫共沉淀法富集與UBAN 相互作用的底物，驗(yàn)證M1-SUB 探針是否具有結(jié)合線性泛素鏈的能力。①把共轉(zhuǎn)染LUBAC復(fù)合體及底物NEMO 的293T 細(xì)胞用裂解液（Na2HPO420 mmol·L-1，NaH2PO420 mmol·L-1，1%NP-40，EDTA 2 mmol·L-1，DTT 1 mmol·L-1，NEM 5 mmol·L-1）裂解，4℃冰箱混懸儀上混懸30 min；②超聲儀超聲裂解細(xì)胞直至裂解液清澈；③4℃，12 000×g離心15 min，留上清，棄沉淀；④把M1-SUB 探針加入細(xì)胞裂解液中，其中每1 mL裂解液對(duì)應(yīng)加入100 μg 探針，于4 ℃冰箱混懸過(guò)夜；⑤用4℃PBS（加0.2%吐溫）將免疫共沉淀后的GST 瓊脂糖微珠洗6 次，每次1 mL，每次混懸10 min；⑥把1×上樣緩沖液加入GST 瓊脂糖微珠中，煮樣25 min；⑦把上述樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，用Western 蛋白印跡法檢測(cè)M1-SUB 探針結(jié)合線性泛素鏈的能力。

1.5 用M1-SUB探針免疫共沉淀富集線性泛素化底物

用RIPA裂解液裂解293T細(xì)胞，用上述所制備探針與293T 細(xì)胞共孵育，富集線性泛素化底物：①根據(jù)定量結(jié)果取M1-SUB探針加入到RIPA裂解液平衡（1 mL 菌液加80 μL M1-SUB 探針），4℃旋轉(zhuǎn)2～3 min 后4℃，600×g離心5 min，棄上清，重復(fù)3 次；②用RIPA 裂解液600 μL 裂解293T 細(xì)胞，加入平衡后的M1-SUB探針?lè)跤Y(jié)合過(guò)夜，4℃，600×g離心5 min，棄上清；③RIPA 裂解液洗滌沉淀，4℃旋轉(zhuǎn)10 min 后4℃，600×g離心5 min，2～3 次；④向沉淀中加入1×上樣緩沖液30 μL，95℃，20 min 使蛋白變性，進(jìn)行SPS-PAGE 電泳分離，隨后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.6 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定潛在線性泛素化底物

①將上述免疫共沉淀樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)分子質(zhì)量把全膠之間的樣品分為4部分，切下目的條帶，置于1.5 mL EP 管中；②每管加入脫色液500 μL 振蕩，更換脫色液至脫色完全，用微型臺(tái)式真空泵吸棄上清；③每管加入75%乙腈200 μL，振蕩30 min，用微型臺(tái)式真空泵吸棄上清；④每管加去離子水500 μL，振蕩60 min，用微型臺(tái)式真空泵吸棄上清，重復(fù)1次；⑤每管加入50 mmol·L-1NH4HCO3溶液300 μL，振蕩5 min后用微型臺(tái)式真空泵吸棄上清；⑥每管加入50 mmol·L-1NH4HCO3溶液20 μL，再加入胰酶1～2 μL后破碎凝膠，37℃溫育6 h，重復(fù)1 次；⑦每管加入100%乙腈200 μL 振蕩5 min，吸取上清移至EP 管；剩余凝膠中再加入0.1%甲酸30 μL振蕩5 min，再加入100%乙腈200 μL振蕩5 min，吸取上清移至同一EP 管中合并，真空干燥；⑧對(duì)干燥后的樣品進(jìn)行LC/MS-MS 質(zhì)譜鑒定，將所獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用Mascot 中的Swissport人源蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，篩查M1-SUB探針與對(duì)照探針中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。質(zhì)譜一級(jí)質(zhì)量的誤差是20 ppm，二級(jí)質(zhì)量的誤差是0.5 u，利用胰蛋白酶進(jìn)行酶切，設(shè)置2個(gè)胰蛋白酶錯(cuò)切位點(diǎn)。

1.7 潛在線性泛素化底物生物功能分析

將質(zhì)譜鑒定的共計(jì)403 個(gè)差異蛋白（最少匹配2個(gè)肽段且質(zhì)譜得分＞10，P＜0.05）通過(guò)WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit 搜索引擎選擇人源種屬進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.8 Western蛋白印跡法驗(yàn)證Aurora-A與線性泛素鏈結(jié)合活性

①將Aurora-A與LUBAC復(fù)合體共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，用加入蛋白酶抑制劑PMSF 1 mmol·L-1，10×phosSTOP 和NEM 20 mmol·L-1的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4℃冰箱混懸儀上混懸30 min；②超聲至細(xì)胞裂解液清澈；③4℃，12 000×g離心10 min，棄沉淀；④重復(fù)步驟③，取10%細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)免疫共淀沉效果；⑤取90%細(xì)胞裂解液加入10%SDS（終濃度為1%），95℃沸水煮5 min；⑥待冷卻后，用加入PMSF 1 mmol·L-1和NEM 2 mmol·L-1的RIPA 裂解液將煮后的上清稀釋10倍；⑦用HA（氨基酸序列為YPYDVPDYA）微珠與其共孵育過(guò)夜，4℃，600×g離心5 min，棄上清；⑧用RIPA 裂解液將沉淀后的微珠洗6 次，每次混懸10 min；⑨棄上清后加入1×上樣緩沖液煮樣25 min，使微珠上結(jié)合的蛋白溶解；⑩取樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，用Western蛋白印跡法檢測(cè)Aurora-A線性泛素鏈的結(jié)合活性。

1.9 Western蛋白印跡法檢測(cè)Aurora-A功能

在HeLa細(xì)胞中干涉LUBAC復(fù)合體三組分，并將細(xì)胞同步化至M期，用Western 蛋白印跡法驗(yàn)證線性泛素化調(diào)控Aurora-A 在細(xì)胞周期中的功能。具體步驟如下：①接種HeLa 細(xì)胞至12 孔板內(nèi)，每孔1×105細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁，細(xì)胞密度達(dá)到約40%時(shí)，將培養(yǎng)基換液成原體系的2/5，將2 μL iMAX和1 μL原濃度為20 μmol·L-1的siRNA分別加入50 μL減血清培養(yǎng)基Opti-MEM中混勻，靜置5 min；②把siRNA 體系與iMAX 體系相互混勻后室溫靜置15 min；③將混合液逐滴均勻加入HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h 后更換為1 mL DMEM 完全培養(yǎng)基；④于第1 次干涉24 h 后重復(fù)上述步驟，再次干涉；⑤將干涉后的細(xì)胞周期同步化至M 期：第2 次干涉6 h 換液，加入濃度為2.5 mmol·L-1的胸苷（thymidine）處理18～24 h。用生理鹽水洗細(xì)胞5～6 次去除胸苷，加入DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4～6 h。加入濃度為100 ng·L-1的諾考達(dá)唑（nocodazole）處理8～10 h，至M 期；⑥用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞并收集裂解上清，用Western蛋白印跡法檢測(cè)Aurora-A磷酸化水平的變化。

2 結(jié)果

2.1 M1-SUB探針中GST-UBAN蛋白的含量

把約10 μL M1-SUB探針結(jié)合的蛋白溶解在上樣緩沖液中，通過(guò)SDS-PAGE電泳分離和考馬斯亮藍(lán)染色，對(duì)該探針?biāo)珿ST-UBAN蛋白含量進(jìn)行大致估算。如圖1所示，用BSA標(biāo)準(zhǔn)品5，10，40，80和120 μg 做定量對(duì)照，分別測(cè)定M1-SUB探針和對(duì)照探針GST-空載體的蛋白含量，分子質(zhì)量分別為35 ku和25 ku。根據(jù)BSA 標(biāo)準(zhǔn)品蛋白條帶大小與目的蛋白條帶大小的對(duì)比，大致估算得出每10 μL M1-SUB探針含有80 μg蛋白。

2.2 M1-SUB域探針與線性泛素鏈的結(jié)合能力

Fig.1 Glutathione S-transferase (GST)-UBAN protein content in M1-SUB probe.The GST-UBAN protein was overexpressed by Escherichia Coli and connected with glutathione agarose beads by GST tag to be used as the UBAN probe（named M1-SUB probe）.The GST-UBAN protein content was tested by SDS-PAGE and Coomassie blue staining.

用M1-SUB 探針免疫共沉淀富集樣品后分別用線性泛素化和NEMO的抗體顯影。如圖2所示，左邊條帶為單獨(dú)轉(zhuǎn)染NEMO的對(duì)照組，在未共轉(zhuǎn)染LUBAC 復(fù)合體時(shí)，NEMO 上發(fā)生線性泛素化修飾的比例和含量極低。右邊條帶為共轉(zhuǎn)染LUBAC復(fù)合體和底物NEMO的實(shí)驗(yàn)組。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組能夠檢測(cè)到極強(qiáng)的線性泛素化修飾條帶和線性泛素化的NEMO條帶。該結(jié)果表明，用M1-SUB探針能夠在293T 中富集線性泛素鏈連接的NEMO，即該蛋白探針能夠與線性泛素鏈發(fā)生極強(qiáng)的相互作用，從而起到底物富集和鑒定的作用。

Fig.2 M1-SUB probe can bind with linear ubiquitination substrate.Using M1-SUB probe，linear ubiquitin chains binding to NEMO were purified from the lysate of 293T cells transfected with the substrate NEMO along with linear ubiquitin chain assembly complex（LUBAC），composed of longer isoform of haem-oxidized iron-regulatory protein ubiquitin ligase 1（HOIL-1）-interacting protein（HOIP），HOIL-1 and Shank-associated RH domain-interacting protein（SHARPIN）.IP：immunoprecipitation.

2.3 用M1-SUB探針富集的潛在線性泛素化底物及其生物功能

用M1-SUB 探針在293T 細(xì)胞中鑒定線性泛素化潛在底物。實(shí)驗(yàn)組利用M1-SUB探針進(jìn)行潛在底物的富集，對(duì)照組為GST-空載體探針，把所富集的底物蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，實(shí)驗(yàn)組中共鑒定到1816個(gè)蛋白，對(duì)照組中共鑒定到1860 個(gè)蛋白。在實(shí)驗(yàn)組中去除對(duì)照組所鑒定到的全部非特異性吸附蛋白，共得到403 個(gè)差異蛋白。如圖3 所示，對(duì)富集到的蛋白進(jìn)行功能聚類分析，在匹配上的402個(gè)蛋白中，潛在底物可能參與細(xì)胞增殖、蛋白合成和降解等多種生物學(xué)過(guò)程。在鑒定到的底物中，根據(jù)底物蛋白功能的重要性和文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果，選擇細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白Aurora-A 進(jìn)行結(jié)合線性泛素鏈活性鑒定和功能檢測(cè)。

Fig.3 Functional clustering analysis of M1-SUB probeenriched linear ubiquitination substrates.403 differential proteins were enriched by M1-SUB probe and identified by mass spectrometry.402 proteins were matched and analyzed using a web-based GEne SeT AnaLysis Toolkit search engine.A：biological process categories；B：cellular component categories；C：molecular function categories.

2.4 潛在底物Aurora-A與線性泛素鏈的結(jié)合活性

為進(jìn)一步驗(yàn)證質(zhì)譜分析的準(zhǔn)確性，在293T 中對(duì)該潛在底物Aurora-A 的線性泛素化能力進(jìn)行驗(yàn)證。圖4結(jié)果表明，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染潛在底物Aurora-A后收集細(xì)胞裂解液，用潛在底物上所帶標(biāo)簽HA 的抗體微珠與細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，隨后通過(guò)Western蛋白印跡法分離免疫共沉淀后所得樣品，用線性泛素化抗體檢測(cè)。與左邊條帶只轉(zhuǎn)潛在底物組相比，右邊條帶在共轉(zhuǎn)染LUBAC復(fù)合體和潛在底物Aurora-A后有線性泛素化修飾的特征帶型。

Fig.4 Linear ubiquitination can combine with Aurora kinase-A（Aurora-A）in 293T cells.HA-Aurora-A protein was purified from 293T cell lysate by anti-HA affinity gel.The linear ubiquitination level of Aurora-A was higher when co-overexpressed with LUBAC（HOIP，HOIL-1 and SHARPIN）except for Aurora-A.

2.5 線性泛素化對(duì)Aurora-A功能的影響

應(yīng)用siRNA 干涉線性泛素化特異性E3 酶LUBAC復(fù)合體3 組分，并利用胸苷和諾考達(dá)唑?qū)eLa細(xì)胞周期同步化至M期，分別用LUBAC復(fù)合體3組分相應(yīng)的抗體檢測(cè)其3組分的干涉效果。如圖5 所示，與未干涉LUBAC 復(fù)合體的對(duì)照組相比，可觀察到Aurora-A 288位蘇氨酸磷酸化水平升高，而該位點(diǎn)磷酸化表示Aurora-A 本身自激活水平。由此提示，Aurora-A的線性泛素化水平能夠影響其自激活能力。

Fig.5 Knockdown of LUBAC increases self-activation of Aurora- A.After knockdown of LUBAC（siHOIP，siHOIL-1 and siSHARPIN）for 48 h in HeLa cells，the cells were then treated with thymidine（2.5 mmol·L-1）for 18-24 h，released with DMEM for 4-6 h，and then added with nocodazole（100 ng·L-1）for 8-10 h to stay in M phase.Then，Western blotting analysis was used to test the phosphorylation level of Aurora-A.

3 討論

線性泛素化在NF-кB 通路和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)，隨著線性泛素化底物的相繼報(bào)道，人們對(duì)這種特殊泛素鏈所調(diào)控的生物學(xué)功能的了解也越來(lái)越深入。本研究將NEMO 中特異性識(shí)別線性泛素化鏈的UBAN 結(jié)構(gòu)域制成探針，利用該探針釣取細(xì)胞裂解液中潛在底物并通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定分析。相較于在肽段水平針對(duì)泛素殘基的特異性抗體免疫純化法和標(biāo)簽富集法而言，此種方法不受限于線性泛素化抗體苛刻的實(shí)驗(yàn)條件，可以直接在細(xì)胞裂解液中進(jìn)行底物蛋白的富集；也不受限于線性泛素鏈特殊的連接方式，不需要在泛素分子首尾添加標(biāo)簽從而破壞其形成線性泛素鏈的能力。此種方法簡(jiǎn)單、高效且易行。

在質(zhì)譜鑒定到的底物中，Aurora-A是細(xì)胞有絲分裂相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的重要成員之一，它在細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。此外，Aurora-A能夠在288位蘇氨酸上發(fā)生磷酸化修飾進(jìn)而促進(jìn)其激活，并且其自身活性在細(xì)胞周期中的G2期至M期轉(zhuǎn)變時(shí)達(dá)到峰值，而在細(xì)胞周期其他時(shí)相中其磷酸化活性極低。為驗(yàn)證質(zhì)譜數(shù)據(jù)的可靠性，本研究利用Western 蛋白印跡法對(duì)Aurora-A上的線性泛素化修飾進(jìn)行了驗(yàn)證；并在細(xì)胞水平首次證實(shí)，在有絲分裂M 期，干涉線性泛素化特異E3酶LUBAC 復(fù)合體3 組分均能夠使Aurora-A 288 位蘇氨酸磷酸化水平升高從而激活A(yù)urora-A。本研究擴(kuò)展了線性泛素化底物及其在細(xì)胞周期中新的調(diào)控功能，即在細(xì)胞有絲分裂中，Aurora-A 的線性泛素化水平能夠調(diào)控其作為細(xì)胞周期相關(guān)激酶的活性，但其在細(xì)胞周期中的作用機(jī)制和其他調(diào)控功能有待進(jìn)一步探索。此外，已知Aurora-A 的活性與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［20］，而線性泛素化修飾在其中扮演的角色和功能尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，

綜上，本研究應(yīng)用UBAN 結(jié)構(gòu)域探針在細(xì)胞裂解液中對(duì)線性泛素化底物進(jìn)行富集，并以此為基礎(chǔ)建立規(guī)模化的親和質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析鑒定到線性泛素化新的底物Aurora-A，這些線索將有利于探索線性泛素化修飾在細(xì)胞周期中新的生物學(xué)功能，擴(kuò)展人們對(duì)線性泛素化修飾調(diào)控細(xì)胞功能的認(rèn)識(shí)。