高原儲存懸浮紅細(xì)胞的質(zhì)量評價(jià)

高鋒華，鄭煥瑛，王福梅，王艷冰，高 亮，徐旭東，王 鈺，張 權(quán)，周 虹，蔣興偉，任素萍，5，于 群，5

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所，北京 100850；2.解放軍第九五〇醫(yī)院，新疆 喀什 844900；3.山東安丘市人民醫(yī)院，山東 安丘 262100；4.西藏阿里軍分區(qū)留守處衛(wèi)生所，新疆 喀什 850000；5.北京航空航天大學(xué)大數(shù)據(jù)精準(zhǔn)醫(yī)療高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083）

在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，將海拔＞3000 m的面積廣闊的地區(qū)稱為高原地區(qū)［1］。我國高原面積廣闊，尤其是青藏高原，總面積約250萬km2，是我國面積最大的高原，海拔在3000～5000 m 之間，平均海拔≥4000 m，被稱為“世界屋脊”，具有低氧、低壓、低溫和強(qiáng)紫外線等特點(diǎn)［2-3］。由于高原地區(qū)環(huán)境特殊，人口稀少，導(dǎo)致血源有限；近年來平原地區(qū)赴高原地區(qū)的游客數(shù)量逐年上升，亦造成意外用血需求增加，致使當(dāng)?shù)赜邢薜尼t(yī)療資源尤其是血液儲備量面臨巨大的挑戰(zhàn)［1，4］。為緩解這一問題，需要將平原地區(qū)的血液調(diào)入高原地區(qū)儲存。

相對于成分復(fù)雜的血液，成分血具有節(jié)約血源、針對性強(qiáng)及便于儲存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)勢，是目前臨床常用的輸血類型。懸浮紅細(xì)胞（suspended red blood cells，SRBC）是全血經(jīng)離心除去大部分（90%）血漿后，加入紅細(xì)胞儲存液制備而成，是目前國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的成分血。我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《全血及成分血質(zhì)量要求》（GB18469-2012）對正常大氣壓下靜置的4℃儲存血質(zhì)量有明確規(guī)定：全血和成分血在4℃條件下儲存期末溶血率＜RBC 總量的0.8%，解凍去甘油RBC 游離血紅蛋白（hemoglobin，Hb）濃度≤1 g·L-1。血液在儲存過程中可能產(chǎn)生的質(zhì)量問題包括代謝和生理性變化，其中代謝變化如pH值下降、三磷酸腺苷和2，3-二磷酸甘油酸含量降低，以及細(xì)胞外K+累積等；生理變化如細(xì)胞滲透脆性增加等生物力學(xué)的改變［5-7］。高原地區(qū)受環(huán)境等不確定因素影響，往往無法滿足常規(guī)儲存血液儲存條件的要求，血液質(zhì)量不能按照現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。因此，需要建立針對高原儲存血液的RBC質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)，作為現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充。

現(xiàn)行血液質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)通過檢測儲存期末溶血率、Hb含量、紅細(xì)胞比容（hematocrit，HCT）和細(xì)胞存活率等指標(biāo)對血液質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，本質(zhì)上反映RBC結(jié)構(gòu)的完整性。能量代謝在RBC結(jié)構(gòu)改變過程中發(fā)生變化，因此通過檢測RBC能量代謝可及時(shí)準(zhǔn)確地反映血液的質(zhì)量。成熟RBC 缺少細(xì)胞核和其他細(xì)胞器，糖酵解是RBC 產(chǎn)生ATP 獲取能量的唯一途徑，通過檢測RBC的能量代謝可以全面準(zhǔn)確地反映血液質(zhì)量［8］。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中制定了細(xì)胞外流量（extracellular flow，XF）分析技術(shù)檢測RBC 能量代謝的方案，并對海上儲運(yùn)血液RBC 的能量代謝進(jìn)行了客觀有效的評價(jià)［9］。該技術(shù)能在活細(xì)胞水平對血液進(jìn)行高通量多指標(biāo)動態(tài)檢測，全面、直接、定量測定RBC 的代謝狀態(tài)［10］。本研究以平原SRBC 和高原SRBC 為研究對象，利用XF 技術(shù)并結(jié)合國家血液質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)綜合判定RBC 質(zhì)量［7，10-12］，探究高原環(huán)境儲存對血液質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 血液、試劑和主要儀器

平原SRBC 是從長期居住在平原地區(qū)（北京）的健康人群采集血液并分離制備，由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心提供，共8 袋（每袋200 mL），用含腺嘌呤的檸檬酸-磷酸-葡萄糖溶液（citrate phosphate dextrose adenine-formula 1，CPDA-1）儲存。高原SRBC 是從長期居住在高原地區(qū)（拉薩）健康人群中采集的血液中分離制備，由西藏軍區(qū)總醫(yī)院提供，共4 袋（每袋200 mL），亦用CPDA-1 儲存。所有產(chǎn)品均經(jīng)乙型肝炎病毒表面抗原、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、抗丙型肝炎病毒和抗人類免疫缺陷病毒抗體等初、復(fù)檢測，檢測結(jié)果合格。

CPDA-1儲存液、葡萄糖、2-脫氧葡萄糖和游離Hb檢測試劑盒（美國，Sigma公司），XF 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、XF 校準(zhǔn)液和XF96 細(xì)胞培養(yǎng)板（美國，Seahorse Bioscience公司），細(xì)胞和組織黏合劑（美國，Corning公司），碳酸氫鈉（北京化學(xué)試劑公司），無DNA酶和RNA酶水（天根生化科技有限公司）。

XF96 型細(xì)胞外流量分析儀（Seahorse Bioscience，美國），LH750型全自動血液分析儀（Beckman，美國），pH211 型pH 計(jì)（HANNA，意大利），MK3 型酶標(biāo)儀、XY300 型電子天平和3111 型CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo，美國），3K15 型高速低溫離心機(jī)（Sigma，美國），MiniSpin型小型臺式離心機(jī)（Eppendorf，德國），SW-CJ-1FD 型超凈工作臺（北京冠鵬凈化設(shè)備有限公司），BCD-190TMPK 型4℃冰箱（海爾公司）。

1.2 SRBC分組和處理

平原SRBC 分別置于3 個不同海拔地區(qū)血庫（北京50 m，拉薩3650 m，林芝3100 m）4℃常規(guī)儲存，分別儲存35 和42 d，各取10 mL 用于檢測。高原SRBC 置于拉薩地區(qū)血庫4℃常規(guī)儲存，分別儲存35 和42 d，各取10 mL 進(jìn)行檢測。利用XF 技術(shù)檢測RBC 胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR），根據(jù)公式計(jì)算基礎(chǔ)糖酵解、葡萄糖反應(yīng)性和糖酵解能力；結(jié)合儲存期末溶血率、Hb含量、HCT 和細(xì)胞存活率血液質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)，綜合判定RBC質(zhì)量。

1.3 鄰甲聯(lián)苯胺法檢測游離Hb濃度

采用鄰甲聯(lián)苯胺法，利用Hb 中亞鐵血紅素在過氧化氫參與下能夠催化鄰甲聯(lián)苯胺顯色的原理檢測游離Hb濃度，具體操作見參考文獻(xiàn)［9］。游離Hb濃度（g·L-1）=（樣品孔A400nm-空白孔A400nm）/（標(biāo)準(zhǔn)品孔A400nm-空白孔A400nm）×100 g·L-1，100 g·L-1為標(biāo)準(zhǔn)品（calibrator）的濃度。

1.4 全自動血液分析儀檢測RBC、SRBC溶血率、總Hb濃度、HCT和細(xì)胞存活率

通過全自動血液分析儀進(jìn)行RBC計(jì)數(shù)、總Hb濃度和HCT 檢測，按儀器操作說明書進(jìn)行。Hb 含量（200 mL SRBC）（g）=Hb（g·L-1）×200 mL，溶血率（%）=（1-HCT）× 游離Hb 濃度/總Hb 濃度×100%，細(xì)胞存活率（%）=儲存后RBC 數(shù)量/儲存前RBC 數(shù)量×100%。

1.5 XF分析技術(shù)檢測紅細(xì)胞能量代謝的變化

利用美國Seahorse Bioscience 公司的XF96型細(xì)胞外流量分析儀檢測RBC 的ECAR 值，根據(jù)ECAR 值計(jì)算得到基礎(chǔ)糖酵解、葡萄糖反應(yīng)性和糖酵解能力3 個指標(biāo)，具體操作見參考文獻(xiàn)［9］。①基礎(chǔ)糖酵解為加入葡萄糖前的ECAR 值，它代表在培養(yǎng)基中無葡萄糖時(shí)，RBC的極限呼吸水平；②葡萄糖反應(yīng)性為加入葡萄糖后的ECAR 值減去加入葡萄糖前的ECAR 值，它代表RBC 對葡萄糖的吸收能力和細(xì)胞代謝的活力；③糖酵解能力為加入葡萄糖后的ECAR 值減去加入2-脫氧葡萄糖后的ECAR值，它代表RBC的能量代謝水平和能力。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用GraphPad 軟件進(jìn)行兩因素方差分析（two-way ANOVA）比較，組間兩兩比較用Tukey 法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高原儲存對平原SRBC溶血率、Hb含量、HCT和細(xì)胞存活率的影響

結(jié)果（圖1）顯示，高原拉薩儲存的平原SRBC儲存35 和42 d 儲存期末溶血率（圖1A）、HCT（圖1B）、Hb 含量（圖1C）和細(xì)胞存活率（圖1D）變化與在北京儲存的平原SRBC 相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。高原林芝儲存平原SRBC 35 d溶血率（圖1A）升高（P＜0.05），但仍在《全血及成分血質(zhì)量要求》規(guī)定的0.8%以內(nèi)，其他指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；儲存42 d儲存期末溶血率（圖1A）、HCT（圖1B）、Hb含量（圖1C）和細(xì)胞存活率（圖1D）變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig.1 Effect of plateau environment on hemolysis ratio（A），hematocrit（HCT，B），hemoglobin（Hb）content（C）and cell viability（D）of plain suspended red blood cells（SRBC）.Plain SRBC（from healthy people living in Beijing）was stored at three different altitudes（Beijing，Lhasa and Linzhi）for 0，35 and 42 d，respectively.Hb content（g）=Hb（g·L-1）×200 mL（SRBC）.±s，n=8.＊P＜0.05，compared with the group in Beijing at the same time.

2.2 高原儲存對平原SRBC基礎(chǔ)糖酵解、葡萄糖反應(yīng)性和糖酵解能力的影響

高原拉薩儲存平原SRBC 35 和42 d，基礎(chǔ)糖酵解（圖2A）、葡萄糖反應(yīng)性（圖2B）和糖酵解能力（圖2C）變化與北京儲存的平原SRBC 相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。高原林芝儲存平原SRBC 35 d 糖酵解能力降低（圖2C）（P＜0.05），其他指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；42 d基礎(chǔ)糖酵解（圖2A）、葡萄糖反應(yīng)性（圖2B）和糖酵解能力（圖2C）變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig.2 Effect of plateau environment on baseline glycolysis（A），glucose response（B）and glycolysis capacity（C）of plain SRBC.See Fig.1 for the SRBC treatment.±s，n=8.＊P＜0.05，compared with the group in Beijing at the same time.

2.3 高原拉薩儲存平原和高原SRBC溶血率、Hb含量、HCT和細(xì)胞存活率的比較

與高原拉薩儲存高原SRBC 相比，高原拉薩儲存平原SRBC 35和42 d，儲存期末溶血率（圖3A）、HCT（圖3B）、Hb含量（圖3C）和細(xì)胞存活率（圖3D）變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且2 種SRBC 在儲存35 和42 d溶血率均低于0.8%，符合血液質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 高原拉薩儲存平原和高原SRBC基礎(chǔ)糖酵解、葡萄糖反應(yīng)性和糖酵解能力的比較

與高原拉薩儲存高原SRBC 相比，高原儲存平原SRBC 35和42 d，基礎(chǔ)糖酵解（圖4A）、葡萄糖反應(yīng)性（圖4B）和糖酵解能力（圖4C）變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明高原拉薩地區(qū)儲存對平原SRBC 的能量代謝無影響。

Fig.3 Comparison between plain SRBC and plateau SRBC in hemolysis ratio（A），HCT（B），Hb content（C）and cell viability（D）after stored in Lhasa.Plain SRBC and plateau SRBC（from healthy people living in Lhasa）were stored in Lhasa for 35 and 42 d，respectively.±s，n=4.

Fig.4 Comparison between plain SRBC and plateau SRBC in baseline glycolysis（A），glucose response（B）and glycolysis capacity（C）after storage in Lhasa.See Fig.3 for the SRBC treatment.±s，n=4.

3 討論

輸血是臨床上治療和搶救患者常用的重要手段，其中血液質(zhì)量是輸血治療成功的關(guān)鍵。影響血液質(zhì)量的因素有很多種，如溫度及運(yùn)輸條件等。因此，在輸血前需要對儲存血液的質(zhì)量進(jìn)行檢測和評估。本研究通過國家血液質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和XF分析技術(shù)從結(jié)構(gòu)與能量代謝角度對高原地區(qū)儲存的SRBC 質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，探究海拔高度是否影響保存SRBC 的質(zhì)量。研究結(jié)果表明，在一定海拔范圍內(nèi)（0～3650 m），采用合適的保存液CPDA-1不影響保存SRBC的質(zhì)量，SRBC可以得到很好的保存，平原SRBC在高原儲存后可以使用。

首先觀察不同海拔高度對平原SRBC 儲存的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與北京儲存平原SRBC 相比，高原拉薩儲存SRBC 35 和42 d，基礎(chǔ)糖酵解、葡萄糖反應(yīng)性和糖酵解能力指標(biāo)未見明顯異常，與國家血液質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)檢測結(jié)果一致。同時(shí)，高原林芝儲存SRBC 42 d，上述能量代謝和血液質(zhì)量指標(biāo)未見明顯異常。上述結(jié)果提示，海拔高度對平原SRBC儲存質(zhì)量無明顯影響。本研究發(fā)現(xiàn)高原林芝儲存SRBC 35 d的溶血率和糖酵解能力發(fā)生變化，這可能與本次樣品從林芝到拉薩運(yùn)輸過程中的顛簸震蕩有關(guān)。震蕩產(chǎn)生的沖擊力擠壓RBC 膜，使RBC 變形甚至破裂溶血［13］。不過僅這1 個時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果不影響對整體趨勢的判斷。

其次，為探討高海拔環(huán)境能否作為血液保存的適合環(huán)境，即保存的血液能否在現(xiàn)行法規(guī)規(guī)定的儲存期末（35或42 d）依然可用，本研究對高原拉薩儲存的平原SRBC 和拉薩當(dāng)?shù)靥峁┑母咴璖RBC 進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)2種SRBC在保存35和42 d時(shí)能量代謝和血液質(zhì)量指標(biāo)均無顯著性差異，且溶血率符合國家血液保存質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，說明平原SRBC 在高原儲存期內(nèi)質(zhì)量良好，可以使用。邊巴瓊達(dá)等［14］對世居高原地區(qū)人群和平原地區(qū)人群進(jìn)行血常規(guī)分析，發(fā)現(xiàn)2組人群的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、RBC計(jì)數(shù)、血小板和Hb等生理指標(biāo)存在差異。他們采用的檢測樣品是抗凝外周血，為全血；本研究采用的檢測樣品為SRBC，是來源于全血的一種血液制品。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《全血及成分血質(zhì)量要求》（GB18469-2012），采用三聯(lián)袋制備SRBC 的過程包括血液保存液稀釋全血、離心去除血漿和添加CPDA-1保存液，經(jīng)過制備過程消除了不同來源血液的差異，使它們在SRBC 水平基本一致。本研究結(jié)果表明，運(yùn)送到高原的平原SRBC 和在高原采集的SRBC 在規(guī)定儲存期內(nèi)質(zhì)量一致，為突發(fā)情況時(shí)平原SRBC 支援高原地區(qū)提供了理論支持。應(yīng)注意的是由于本次研究樣本量較少，還需加大樣本量對此結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究將XF 分析技術(shù)應(yīng)用于高原特殊環(huán)境儲存血液能量代謝評價(jià)，在活細(xì)胞水平對RBC 的能量代謝進(jìn)行連續(xù)、動態(tài)的檢測，并結(jié)合現(xiàn)有的血液質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對高原存儲后的血液質(zhì)量進(jìn)行綜合判斷，為平原血液補(bǔ)給高原地區(qū)提供了理論支持，為完善高原環(huán)境下血液質(zhì)量評價(jià)體系的建立提供參考。