孕期地塞米松暴露可致雌性胎大鼠軟骨發(fā)育不良及發(fā)生機(jī)制

黎 偉，秦 俊，文印憲，汪 暉，陳廖斌，3

（武漢大學(xué)1.中南醫(yī)院骨科，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，3.發(fā)育源性疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430071）

地塞米松作為一種合成類糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）可透過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，促進(jìn)胎肺等重要臟器成熟并降低呼吸窘迫綜合征的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［1-2］，因此被廣泛應(yīng)用于有早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的孕婦。近年來研究表明，孕期地塞米松暴露（prenatal dexamethasone exposure，PDE）不僅可抑制胎兒宮內(nèi)發(fā)育，引起出生體質(zhì)量和體長(zhǎng)下降［3-4］，而且會(huì)導(dǎo)致出生后多種成年疾病易感［5］。近期，我們通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PDE 具有子代關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育毒性［6］，但其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。

蛋白聚糖（proteoglycan，PG）是軟骨結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)［7］，主要在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中大量聚集形成聚集PG，糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）是其主要成分。軟骨組織中GAG 合成的關(guān)鍵在于四糖結(jié)構(gòu)的合成，木糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（O-xylosyltransferaseⅠ，XylT-Ⅰ），半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（β1，4-galactosyltransferase 7，GalT-Ⅰ），半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ（β1，3-galactosyltransferase 6，GalT-Ⅱ）和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（β1，3-glucuronosyltransferaseⅠ，GlcAT-Ⅰ）是“四糖結(jié)構(gòu)”合成中的關(guān)鍵催化酶［8］。胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）是胎兒期軟骨發(fā)育過程中重要的調(diào)節(jié)因子［9］。IGF-1 可通過IGF-1 受體（IGF-1 receptor，IGF-1R）刺激PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號(hào)通路［10］，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的基質(zhì)合成［11］。磷酸化的AKT可激活活化蛋白1（activator protein-1，AP-1）［12-13］，激活的AP-1 轉(zhuǎn)運(yùn)至胞核內(nèi)與基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合啟動(dòng)基因的表達(dá)［12］。研究發(fā)現(xiàn)，糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferases，GT）中的XylT-Ⅰ［14］，GalT-Ⅰ［15］和GlcAT-Ⅰ［16］基因啟動(dòng)子區(qū)均包含有AP-1 結(jié)合位點(diǎn)，可能參與GT基因表達(dá)的調(diào)控。本研究在前期已穩(wěn)定建立的PDE 模型上，研究子代宮內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育，以闡明PDE對(duì)子代關(guān)節(jié)軟骨IGF-1/AKT/AP-1通路及GT對(duì)軟骨發(fā)育影響的作用機(jī)制，為研究PDE致子代胎軟骨發(fā)育毒性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

地塞米松購(gòu)自武漢雙鶴公司；異丙醇和三氯甲烷購(gòu)自上海藥化公司；IGF-1R抑制劑NVP-AEW541和AKT 抑制劑MK-2206 購(gòu)自上海藍(lán)木化工公司；AP-1 抑制劑SR-11302 購(gòu)自美國(guó)R & D Systems 公司；Trizol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程公司；青鏈雙抗、RIPA 裂解液及蛋白定量試劑盒（BCA）均購(gòu)自碧云天公司；兔抗IGF-1多克隆抗體，小鼠抗AKT單克隆抗體，兔抗AP-1多克隆抗體，小鼠抗GlcAT-Ⅰ單克隆抗體和小鼠抗XylT-Ⅰ單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；兔抗GalT-Ⅰ單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；辣根過氧化酶標(biāo)記二抗（山羊抗兔IgG 和山羊抗小鼠IgG）購(gòu)自美國(guó)Pierce Biotechnology 公司；Ⅱ型膠原酶、硫酸軟骨素和DMB試劑均購(gòu)自科瑞生物公司；引物均由上海生工合成；其他試劑均為國(guó)內(nèi)分析純。

1.2 動(dòng)物處理

于湖北省疾病預(yù)防控制中心購(gòu)買成年健康雌性（180～220 g）和雄性（260～300 g）Wistar 大鼠（合格證號(hào)：420006-00002258），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK（鄂）2012-2014。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每晚按每籠6雌3雄合籠，次日上午進(jìn)行雌鼠陰道涂片鏡檢，以查到精子之日計(jì)為受孕0天（gestational day 0，GD0）。受孕大鼠隨機(jī)分正常對(duì)照組和PDE 組，每組8 只。PDE 組從GD9 起sc 給予地塞米松0.2 mg·kg-1，連續(xù)給藥至GD20；正常對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水?；诒臼仪捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)，孕期外源物暴露所致雌性子代軟骨發(fā)育不良及胎源性骨關(guān)節(jié)炎易感［17-18］，在GD20用異氟烷麻醉孕鼠，剖腹取出雌性胎鼠并收集膝關(guān)節(jié)組織。

1.3 雌性胎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的制備

另取GD20 Wistar 孕鼠頸椎脫位法處死［18］，在75%乙醇浸泡10 min，剖腹取出雌性胎鼠，超凈臺(tái)內(nèi)無菌削取標(biāo)本得到關(guān)節(jié)軟骨片，剪成1 mm3小塊。用0.2%Ⅱ型膠原酶37℃水浴消化2～4 h 成絮狀。加入全培養(yǎng)液重懸，獲得軟骨細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)單層培養(yǎng)。隔天換液，待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿后傳代培養(yǎng)。傳至第3 代時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度為1x108L-1接種于培養(yǎng)板培養(yǎng)，并給予地塞米松（100 和500 nmol·L-1），IGF-1（100 μg·L-1），NVPAEW541（1 μmol·L-1），MK-2206（1 μmol·L-1）和SR-11302（1 μmol·L-1）處理24 h，收集細(xì)胞和細(xì)胞上清液，應(yīng)用DMB檢測(cè)細(xì)胞上清GAG含量，實(shí)時(shí)定量PCR 和Western 蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞IGF-1/AKT/AP-1 通路相關(guān)蛋白及XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ基因和蛋白表達(dá)。

1.4 HE和番紅O染色觀察雌性胎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)

將胎大鼠膝關(guān)節(jié)固定于中性甲醛，1 d 后直接脫水包埋固定。每組隨機(jī)選取5 個(gè)膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，將其切成厚度為5 μm的矢狀位切片，進(jìn)行HE和番紅O染色，在醫(yī)學(xué)光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨組織形態(tài)。

1.5 免疫組化法檢測(cè)雌性胎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織lGF-1，AKT，AP-1，XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-Ⅰ蛋白表達(dá)

按SP免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒說明書進(jìn)行。采用ImagePro-6.0 軟件進(jìn)行圖形半定量分析，每張照片在關(guān)節(jié)軟骨區(qū)采集10個(gè)區(qū)域，計(jì)算平均吸光度值（mean absorbance，MA），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 DMB染色法檢測(cè)雌性胎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞上清GAG含量水平

取400 μL 各組軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，加入1 mL 木瓜蛋白酶消化液，60℃消化60 min，加入20 mmol·L-1碘酸和50 mmol·L-1的Tris-HCl，再加入DMB顯色劑2.5 mL，加入雙蒸水將每個(gè)樣本定容到4 mL，充分混勻，反應(yīng)15 s后，于分光光度儀525 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以硫酸軟骨素作為標(biāo)準(zhǔn)品等比稀釋制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本中GAG的含量。

1.7 Western蛋白印跡法檢測(cè)雌性胎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表達(dá)水平

RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。BCA法檢測(cè)樣本蛋白質(zhì)濃度，并將其調(diào)整為2.5 g·L-1，加入5×蛋白上樣緩沖液后100℃水浴10 min，-20℃保存。配制5%濃縮膠和分離膠，電泳，醋酸纖維膜轉(zhuǎn)印。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4℃下加一抗〔GlcAT-Ⅰ（1∶500），XylT-Ⅰ（1∶500）或GalT-Ⅰ（1∶1000）〕孵育過夜。TBST洗膜3次，室溫下二抗（1∶5000）孵育2 h。TBST 洗膜3 次，ECL 顯色劑顯影。Chemi-doc Image Analyzer系統(tǒng)拍照記錄。Image Tool 3.0軟件分析蛋白條帶積分吸光度，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度的比值表示其相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)雌性胎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中蛋白聚糖及膝關(guān)節(jié)軟骨組織和軟骨細(xì)胞XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ，IGF-1，IGF-1R，AKT和AP-1mRNA表達(dá)水平

Trizol 試劑提取總RNA?？俁NA 濃度調(diào)整為300 mg·L-1后逆轉(zhuǎn)錄，調(diào)整cDNA濃度1000 mg·L-1，實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)mRNA 表達(dá)水平。PCR 條件（表1）為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，退火30 s，72℃延伸30 s，后3 步設(shè)40 循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

Tab.1 Primer sequences and optional PCR conditions

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以±s表示，采用SPASS 17.0系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕期地塞米松暴露對(duì)雌性胎大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織發(fā)育和基質(zhì)合成的影響

HE 染色結(jié)果顯示，PDE 組雌性胎大鼠關(guān)節(jié)軟骨未見明顯結(jié)構(gòu)紊亂，但其軟骨細(xì)胞數(shù)減少，表層軟骨細(xì)胞排列紊亂。番紅O染色結(jié)果顯示，PDE組出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)染色著色變淺、著色不均一等現(xiàn)象（圖1）。提示PDE組雌性胎大鼠宮內(nèi)時(shí)期關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)含量降低，且關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育不良。

Fig.1 Effect of prenatal dexamethasone exposure（PDE）on chondrogenesis knee articular cartilage in offspring female fetal rats by HE staining and Safranin O staining.From gestational day 9（GD9），pregnant Wistar rats were sc given daily dexamethasone 0.2 mg·kg-1.On GD20，pregnant rats were anesthetized and knee tissue of female fetal rats was collected.

2.2 孕期地塞米松暴露對(duì)雌性胎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和lGF-1/AKT/AP-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

免疫組化結(jié)果顯示（圖2A），與正常對(duì)照組相比，PDE組雌性胎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ，IGF-1，AKT 和AP-1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01，圖2B），提示PDE 可導(dǎo)致雌性胎大鼠宮內(nèi)期軟骨關(guān)節(jié)組織中XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和IGF-1/AKT/AP-1通路蛋白表達(dá)水平降低。

Fig.2 Effect of PDE on expression of XylT-Ⅰ,GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰand proteins related to lGF-1/AKT/AP-1 signaling pathway of knee articular cartilage in offspring fetal female rats by immunohistochemical assays.See Fig.1 for the rat treatment.MA：mean absorbance.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 孕期地塞米松暴露對(duì)雌性胎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織蛋白聚糖，XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和lGF-1/AKT/AP-1通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，PDE組雌性胎大鼠關(guān)節(jié)軟骨中蛋白聚糖，XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ，IGF-1，IGF-1R，AKT和AP-1mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05，P＜0.01，圖3），提示PDE可導(dǎo)致雌性胎大鼠宮內(nèi)時(shí)期關(guān)節(jié)軟骨組織中蛋白聚糖，XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和IGF-1/AKT/AP-1 通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平降低。

Fig.3 Effect of PDE on mRNA expression of aggrecan，XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰand proteins related to lGF-1/AKT/AP-1 signaling pathway in knee articular cartilage of offspring fetal female rats.See Fig.1 for the rat treatment.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.4 地塞米松對(duì)雌性胎大鼠膝軟骨細(xì)胞GAG含量的影響

DMB法檢測(cè)細(xì)胞上清GAG含量，結(jié)果顯示（圖4），與正常對(duì)照組相比，地塞米松100和500 nmol·L-1組軟骨細(xì)胞上清GAG 含量不同程度降低（P＜0.05）；與地塞米松500 nmol·L-1組相比，同時(shí)加入IGF-1 100 μg·L-1處理后，GAG含量升高（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of dexamethasone on glycosaminoglycan（GAG）content of offspring fetal rat chondrocytes.GD20 pregnant Wistar rats were sacrificed by cervical dislocation method，and female fetal articular cartilage slices were extracted to prepare chondrocyte suspension.Different drugs were treated for 24 h.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with dexamethasone 500 nmol·L-1 group.

2.5 地塞米松對(duì)雌性胎大鼠軟骨細(xì)胞XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和lGF-1/AKT/AP-1通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平的影響

與正常對(duì)照組相比，地塞米松100和500 nmol·L-1組軟骨細(xì)胞XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ，IGF-1R，AKT和AP-1mRNA 表達(dá)水平均呈不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01，圖5），提示地塞米松可降低XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和IGF-1/AKT/AP-1通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平。與地塞米松500 nmol·L-1組相比，同時(shí)給予IGF-1 100 μg·L-1，上述mRNA表達(dá)水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）。提示IGF-1可逆轉(zhuǎn)地塞米松的抑制作用。

Fig.5 Effect of dexamethasone on mRNA expression of XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ，GalT-Ⅰand proteins related to lGF-1/AKT/AP-1 signaling pathway of fetal female rat chondrocytes.See Fig.4 for the cell treatment.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with dexamethasone 500 nmol·L-1 group.

2.6 lGF-1和lGF-1R/AKT/AP-1抑制劑對(duì)雌性胎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-ⅠmRNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比（圖6），IGF-1處理組XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-ⅠmRNA表達(dá)水平升高，IGF-1R/AKT/AP-1 各抑制劑處理組XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-ⅠmRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05，P＜0.01），提示IGF-1 增加GTmRNA 表達(dá)水平，而IGF-1R/AKT/AP-1 各抑制劑降低GTmRNA 表達(dá)水平。與單獨(dú)SR-11302 組相比，同時(shí)加入IGF-1 處理后，XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-ⅠmRNA 表達(dá)水平變化不明顯。提示IGF-1不能消除SR-11302對(duì)XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-ⅠmRNA表達(dá)水平的抑制作用。

Fig.6 Effect of lGF-1，lGF-1R inhibitor（NVP-AEW541），AKT inhibitor（MK-2206）and AP-1 inhibitor（SR-11302）on mRNA expression of XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰand GalT-Ⅰof fetal female rat chondrocytes.Chondrocytes were treated with IGF-1 100 μg·L-1 AVP-AEW541 1 μmol·L-1，MK-2206 1 μmol·L-1 and SR-11302 1 μmol·L-1 for 24 h，respectively.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.7 lGF-1和lGF-1R/AKT/AP-1各抑制劑對(duì)雌性胎大鼠膝軟骨細(xì)胞XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表達(dá)水平的影響

Western 蛋白印跡結(jié)果（圖7）顯示，與正常對(duì)照組相比，IGF-1處理組XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表達(dá)水平升高，IGF-1R/AKT/AP-1各抑制劑處理組XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05，P＜0.01），提示IGF-1 增加XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表達(dá)水平；而IGF-1R/AKT/AP-1 各抑制劑降低XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表達(dá)水平。與單獨(dú)SR-11302 組相比，同時(shí)加入IGF-1 處理后，XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GALT-Ⅰ蛋白表達(dá)水平變化不明顯。提示IGF-1 不能消除SR-11302 對(duì)XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ和GalT-Ⅰ蛋白表達(dá)水平的抑制作用。

Fig.7 Effect of lGF-1，NVP-AEW541，MK-2206 and SR-11302 on protein expression of XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰand GalT-Ⅰof fetal female rat chondrocytes.See Fig.6 for the cell treatment.B1-B3 were the semiquantitative results of A.IA：integrated absorbance.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

3 討論

本研究在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PDE可導(dǎo)致雌性胎大鼠關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育不良，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)含量降低，PG含量顯著減少，同時(shí)IGF-1/AKT/AP-1通路相關(guān)蛋白mRNA 和XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ及GalT-ⅠmRNA和蛋白表達(dá)降低。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，地塞米松可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞上清GAG 水平降低，同時(shí)IGF-1/AKT/AP-1 通路相關(guān)蛋白和XylT-Ⅰ，GlcAT-Ⅰ及GalT-ⅠmRNA表達(dá)降低。

關(guān)節(jié)軟骨主要在胚胎期生成并發(fā)育成熟，在這一過程中軟骨細(xì)胞增殖、體積變大并分泌細(xì)胞外基質(zhì)［19］。研究表明，PDE 可導(dǎo)致子代關(guān)節(jié)軟骨變薄，軟骨細(xì)胞數(shù)目減少［20］。本研究結(jié)果表明，PDE子代雌性胎鼠在GD20 時(shí)，軟骨細(xì)胞數(shù)目減少、排列紊亂，細(xì)胞外基質(zhì)aggrecan 含量顯著降低。提示PDE可致關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育毒性，其主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)含量降低。

PG 含有多種組成成分，其中GAG是其主要成分［21］。XylT-Ⅰ，GALT-Ⅰ，GalT-Ⅱ和GlcAT-Ⅰ為四糖結(jié)構(gòu)合成的關(guān)鍵酶［22］。研究表明，應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默HeLa細(xì)胞GalT-Ⅱ基因可急劇減少GAG的合成［23］。本室前期研究表明，抑制大鼠軟骨細(xì)胞XylT-Ⅰ和GlcAT-Ⅰ基因表達(dá)可抑制GAG 的合成［24］。以上說明XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-Ⅰ在GAG 合成中起著重要作用。本研究結(jié)果表明，在GD20 時(shí)，PDE 組胎大鼠關(guān)節(jié)軟骨局部XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-Ⅰ的mRNA 和蛋白水平降低，這些改變與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)PG含量下降一致。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，軟骨細(xì)胞給予地塞米松處理后，XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-ⅠmRNA 表達(dá)下降，細(xì)胞上清GAG水平也降低，提示關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)含量降低可能源于地塞米松所致XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-ⅠmRNA表達(dá)降低后GAG合成不足。

已有文獻(xiàn)提示，IGF-1對(duì)宮內(nèi)期胚胎生長(zhǎng)和組織發(fā)育起到重要作用［25］，通過與其受體IGF-1R 結(jié)合后，活化酪氨酸蛋白激酶，進(jìn)而磷酸化PI3K/AKT，引起細(xì)胞增殖、分化和代謝等功能變化［26］。本研究結(jié)果表明，PDE可致雌性胎鼠軟骨IGF-1/AKT/AP-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)降低。據(jù)報(bào)道，地塞米松可抑制多種組織或細(xì)胞內(nèi)IGF-1基因表達(dá)［27-28］。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，地塞米松可抑制IGF-1/AKT/AP-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)，IGF-1可逆轉(zhuǎn)地塞米松對(duì)IGF-1/AKT/AP-1 通路相關(guān)蛋白的抑制作用。有文獻(xiàn)提示，IGF-1R/AKT/AP-1 抑制劑可抑制IGF-1 通路介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞PG 合成［29］。因此，未進(jìn)一步研究地塞米松處理后AKT反向激活下對(duì)軟骨細(xì)胞PG合成的影響。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IGF-1可升高軟骨細(xì)胞XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-ⅠmRNA和蛋白表達(dá)水平，IGF-1R/AKT/AP-1 各抑制劑均可降低軟骨細(xì)胞XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-ⅠmRNA和蛋白表達(dá)水平，IGF-1聯(lián)合AP-1抑制劑SR-11302不能消除AP-1抑制劑的抑制效應(yīng)，說明AP-1在調(diào)節(jié)XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-Ⅰ表達(dá)方面起關(guān)鍵作用。以上結(jié)果提示，地塞米松通過IGF-1/AKT/AP-1信號(hào)通路抑制XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-ⅠmRNA和蛋白表達(dá)。

綜上所述，PDE可致雌性胎大鼠軟骨發(fā)育不良，其機(jī)制可能是PDE致關(guān)節(jié)軟骨IGF-1/AKT/AP-1通路低活性，降低XylT-Ⅰ，GalT-Ⅰ和GlcAT-ⅠmRNA和蛋白表達(dá)，從而抑制軟骨基質(zhì)合成。本研究為探尋地塞米松對(duì)關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育毒性作用機(jī)制提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。