厄洛替尼聯(lián)合康萊特對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲及JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響

江國(guó)強(qiáng)，方 芳

武警四川省總隊(duì)醫(yī)院呼吸科 四川樂(lè)山 614000

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是我國(guó)因癌癥而引起死亡的首要因素；近些年其發(fā)病率呈上升和年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人們的健康[1-2]。肺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移是臨床上治療的一大難題。厄洛替尼是一種口服的表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，可通過(guò)對(duì)酪氨酸激酶的靶向抑制而阻斷增殖信號(hào)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的效果；由于厄洛替尼具有良好的安全性及顯著的療效，目前已廣泛應(yīng)用于臨床[3-4]。有多項(xiàng)研究[5-6]顯示厄洛替尼可聯(lián)合山奈酚、靶向生存素的siRNA等影響肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡?？等R特注射液是從中藥薏苡仁中提取出來(lái)的一種新型的抗腫瘤藥物，對(duì)胃癌、胰腺癌等多種腫瘤具有抑制和殺傷作用，可有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[7-8]。目前關(guān)于厄洛替尼和康萊特聯(lián)合能否產(chǎn)生協(xié)同作用治療肺癌還未可知，因此，作者進(jìn)行了如下研究，以期為肺癌的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器康萊特注射液(生產(chǎn)批號(hào)：1202141-2)購(gòu)自浙江康萊特藥物有限公司，厄洛替尼購(gòu)自上海羅氏有限公司(貨號(hào):BDX034001C)；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，PVDF膜購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司；Matrigel人工基底膜、Transwell侵襲小室均購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Ki-67、E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、JAK2和磷酸化(磷酸化位點(diǎn)Y1007)JAK2(p-JAK2)、STAT3和磷酸化(磷酸化位點(diǎn)Y705)STAT3(p-STAT3)抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞中心。取出在液氮罐凍存的A549細(xì)胞，即刻37 ℃水浴解凍，解凍后細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中、于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，每隔2～3 d用胰蛋白酶消化傳代。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3各組細(xì)胞活力的檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞分為對(duì)照組(細(xì)胞不經(jīng)特殊處理)、厄洛替尼組(10 mg/L的厄洛替尼處理)[9]、康萊特組(20 mg/L的康萊特處理)[10]和聯(lián)合組(10 mg/L的厄洛替尼和20 mg/L的康萊特共同處理)。以5×104個(gè)/mL的密度(每孔150 μL)接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞于96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照上述分組處理，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分組培養(yǎng)48 h以后，加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出上清，加入150 μL的DMSO溶液，振蕩混勻10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(波長(zhǎng)為490 nm)，以吸光度值反映細(xì)胞活力。

1.4各組細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)4 ℃冰箱中將Matrigel基質(zhì)膠融化，按照1∶6的體積比將融化的基質(zhì)膠用預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋。在Transwell小室的上室鋪上基質(zhì)膠100 μL，操作過(guò)程中不能產(chǎn)生氣泡，并在37 ℃培養(yǎng)箱中3～5 h以待成膠，將殘留在小室內(nèi)的液體吸出，每孔加入100 μL預(yù)熱的無(wú)血清培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)1 h。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，按照1.3項(xiàng)分組(每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔)接種。同時(shí)在下室每孔加入含血清的培養(yǎng)基500 μL。分組培養(yǎng)48 h，取出小室，棉簽輕輕擦掉上室Matrigel膠及未遷移的細(xì)胞，室溫條件下，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，1 g/L結(jié)晶紫染色10 min，磷酸鹽緩沖液洗滌后，在200倍顯微鏡下選擇5個(gè)視野觀察，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.5各組細(xì)胞中Ki-67、E-cadherin、MMP-2、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)于各處理組(同1.3項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)分組)細(xì)胞中加入適量的細(xì)胞裂解液，BCA法測(cè)定總蛋白的濃度。每泳道上樣40 μg，SDS-PAGE后轉(zhuǎn)PVDF膜、封閉，加Ki-67、E-cadherin、MMP-2、p-JAK2、p-STAT3抗體(皆按照1∶500稀釋)和GAPDH(1∶1 000稀釋)抗體4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，加入稀釋好的二抗，孵育2 h，取出PVDF膜，加入1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫條件孵育1.5 h，ECL顯色，暗室中顯影定影。以目的蛋白和內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行分析，應(yīng)用析因設(shè)計(jì)的方差分析比較厄洛替尼和康萊特單獨(dú)或聯(lián)用對(duì)肺癌細(xì)胞活力，侵襲能力，Ki-67、E-cadherin蛋白及JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1厄洛替尼和康萊特單獨(dú)或聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞活力和侵襲能力的影響見(jiàn)表1。由表1可知，厄洛替尼或康萊特單獨(dú)使用均可抑制A549細(xì)胞活力和侵襲能力，二者聯(lián)用后作用增強(qiáng)。

表1 4組細(xì)胞活力、細(xì)胞侵襲能力的比較(n=5)

2.2厄洛替尼和康萊特單獨(dú)或聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞Ki-67、E-cadherin和MMP-2蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖1、表2。由表2可知，厄洛替尼或康萊特單獨(dú)使用均可抑制A549細(xì)胞Ki-67、MMP-2的表達(dá)，增加E-cadherin蛋白的表達(dá)，二者聯(lián)用后該作用增強(qiáng)。

2.3厄洛替尼和康萊特單獨(dú)或聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路活化的影響見(jiàn)圖2、表3。由表3可知，厄洛替尼和康萊特單獨(dú)使用對(duì)A549細(xì)胞JAK2和STAT3的表達(dá)均無(wú)影響，但可抑制p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)；二者聯(lián)用后作用增強(qiáng)。

1：對(duì)照組；2：厄洛替尼組；3：康萊特組；4：聯(lián)合組

1：對(duì)照組；2：厄洛替尼組；3：康萊特組；4：聯(lián)合組

3 討論

有研究[11]顯示，厄洛替尼可有效阻止EGFR跨膜表達(dá)受體酪氨酸激酶磷酸化，從而抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。康萊特是薏苡仁中的一種天然有效的活性成分，具有抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、阻滯癌細(xì)胞分裂等作用，可有效逆轉(zhuǎn)耐藥和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子[12-13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，厄洛替尼和康萊特均能有效抑制A549細(xì)胞活力和侵襲能力，兩者聯(lián)用對(duì)細(xì)胞活力和侵襲能力產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制作用，提示厄洛替尼和康萊特可聯(lián)合用于肺癌的治療。

肺癌的增殖及侵襲受到多種基因的影響。JAK2/STAT3信號(hào)被激活，可通過(guò)影響下游相關(guān)分子Ki-67、E-cadherin、MMP-2等影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14-15]。Ki-67是一個(gè)與細(xì)胞增殖關(guān)系密切的核蛋白，可作為細(xì)胞增殖活性的標(biāo)記物，由于其檢測(cè)較為準(zhǔn)確、理想和可靠，目前已得到廣泛應(yīng)用[16]。E-cadherin為cadherin家族中的一個(gè)成員，在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中有重要作用，在多種組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)能有效地抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[17-18]。MMP-2為MMP家族中重要的一員，其表達(dá)與癌細(xì)胞的侵襲有關(guān)，MMP-2高表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲能力，血清MMP-2表達(dá)水平也可作為肺癌預(yù)后判斷的一個(gè)輔助指標(biāo)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，厄洛替尼和康萊特均可降低A549細(xì)胞中Ki-67、MMP-2及JAK2/STAT3信號(hào)通路p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，而聯(lián)用作用更明顯。

綜上所述，厄洛替尼和康萊特均能抑制肺癌細(xì)胞活力及侵襲能力，兩者聯(lián)用效果更強(qiáng)，其機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。