食管癌組織中IDO1的表達(dá)及犬尿酸對間皮素CAR-T細(xì)胞功能的影響

劉裕琳，張 震，曹 玲，申春一，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052 3)河南省腫瘤免疫和生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 4)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 鄭州 450001 5)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

免疫療法被認(rèn)為是繼手術(shù)、放療、化療及靶向治療之后的腫瘤第五大治療手段[1]，如今免疫治療已在多種腫瘤中展現(xiàn)出良好的治療效果，并成為部分腫瘤的一線療法[2]。嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)是一種可以模擬T細(xì)胞受體(T-cell receptor，TCR)功能的人工受體T細(xì)胞，當(dāng)嵌合抗原受體的抗體(配體)與腫瘤細(xì)胞表面的抗原(受體)結(jié)合時，通過鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)將信號傳遞至胞內(nèi)并轉(zhuǎn)化為活化信號，激活的效應(yīng)細(xì)胞通過分泌穿孔素或細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞[3-4]。CAR-T細(xì)胞治療在白血病等血液系統(tǒng)腫瘤中效果良好。但在實(shí)體瘤治療中，CAR-T細(xì)胞的進(jìn)展一直相對滯后，并且在治療中存在很大的局限性，一個重要的原因就是在實(shí)體瘤中由于多種免疫逃逸種機(jī)制的作用，易形成腫瘤免疫抑制微環(huán)境，使CAR-T細(xì)胞功能受到了抑制[5-6]。吲哚加雙氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1, IDO1)屬于含血紅素的單體氧化還原酶類，是介導(dǎo)人必需氨基酸色氨酸轉(zhuǎn)化為犬尿酸的代謝限速酶[7]，IDO1的代謝產(chǎn)物犬尿酸在發(fā)揮免疫抑制功能中起到重要的作用，最近有研究[8]發(fā)現(xiàn)清除體內(nèi)的犬尿酸可以逆轉(zhuǎn)IDO1誘導(dǎo)的T細(xì)胞功能抑制，但是犬尿酸是否會影響CAR-T細(xì)胞的功能尚不明確。中國是世界上食管癌發(fā)病率、死亡率最高的國家之一[9]，并且患者的5 a生存率不超過20%。CAR-T細(xì)胞治療的出現(xiàn)，給食管癌的治療帶來了新的希望[10]。本文對食管癌組織中IDO1的表達(dá)與患者生存狀況進(jìn)行了分析，觀察犬尿酸對間皮素CAR-T功能的影響。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫及臨床資料食管癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料均來自TCGA(The Cancer Genome Atlas，https://tcga-data.nci.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫。從TCGA數(shù)據(jù)庫中收集186例食管癌腫瘤組織和12例正常食管黏膜組織中IDO1的基因表達(dá)數(shù)據(jù)；收集腫瘤患者10 a隨訪資料(終點(diǎn)為死亡)，剔除14例生存資料不完整的腫瘤患者，根據(jù)IDO1表達(dá)的中位數(shù)將患者分為高表達(dá)組(n=86)和低表達(dá)組(n=86)，繪制腫瘤患者的生存曲線。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)人胚腎293T細(xì)胞系和表達(dá)間皮素的食管癌細(xì)胞系KYSE510購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，CD8+T細(xì)胞及間皮素CAR-T細(xì)胞從健康供者外周血中分離或轉(zhuǎn)染得到。293T細(xì)胞用DMEM-H培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)培養(yǎng)，KYSE510細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及間皮素CAR-T細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中分別加入體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清(美國Gibco公司)和100 U/mL的青霉素和50 g/L的鏈霉素，細(xì)胞均培養(yǎng)于37 ℃含有體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.3間皮素CAR-T細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)染效率鑒定人外周血單個核細(xì)胞的獲取及CD8+T細(xì)胞的磁分選參考文獻(xiàn)[11]。采用序列合成方法將識別間皮素抗原的間皮素-scFv連接至CD3和CD28的信號區(qū)，再將其克隆入慢病毒載體中，構(gòu)建含間皮素抗原受體基因及其重組表達(dá)載體，并測序驗(yàn)證間皮素CAR載體構(gòu)建成功。培養(yǎng)人胚腎293T細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，采用病毒包裝的方法將質(zhì)?；旌衔锏稳?93T細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48、72 h后收集含病毒的上清液，感染CD8+T細(xì)胞，獲得間皮素CAR-T細(xì)胞。取間皮素CAR-T細(xì)胞于1.5 mL離心管中，PBS洗滌后直接上流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率達(dá)58.5%可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4間皮素CAR-T細(xì)胞表面分子的檢測收集符合實(shí)驗(yàn)的間皮素CAR-T細(xì)胞，分為對照組和犬尿酸處理組(加終濃度為200 μmol/L犬尿酸)，培養(yǎng)48 h后，收集2組細(xì)胞于1.5 mL離心管中，用PBS洗滌，再分別避光加入CD8-APC-Cy7、CD28-APC和PD-1-PE-Cy7流式抗體(美國Biolegend公司)4 ℃孵育20 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.5間皮素CAR-T細(xì)胞胞內(nèi)因子分泌的檢測分別在兩細(xì)胞中加入佛波酯(PMA，50 mg/L)及離子霉素(750 mg/L)，培養(yǎng)箱中孵育1 h后，加入阻斷劑布雷非德菌素A(brefeldin A，BFA)(美國Sigma公司)，充分混合，繼續(xù)培養(yǎng) 5 h。收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，用PBS洗滌，用固定劑重懸，4 ℃避光孵育30 min。離心棄上清后，加入破膜劑，4 ℃避光孵育30 min。離心棄上清后再加入破膜劑重懸細(xì)胞，分別避光加入CD8-APC-Cy7、IFN-γ-PE-Cy7和IL-2-APC流式抗體4 ℃孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6間皮素CAR-T細(xì)胞殺傷能力的檢測將2組間皮素CAR-T細(xì)胞與KYSE510按效靶比10∶1共孵育，6 h后收集細(xì)胞，PBS清洗，避光加入CD8-APC-Cy7和CD107a-APC流式抗體，上流式細(xì)胞儀檢測KYSE510細(xì)胞凋亡率，表示間皮素CAR-T細(xì)胞的殺傷能力。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0或GraphPad Prism 7進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制食管癌患者生存曲線并行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較2組間皮素CAR-T細(xì)胞表面分子、細(xì)胞內(nèi)因子分泌水平和細(xì)胞殺傷能力的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1食管癌組織中IDO1的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系IDO1在食管癌組織中的表達(dá)(2.647 ±0.139)高于食管正常組織(0.798±0.142)(t=3.368，P<0.001)。食管癌患者中IDO1低表達(dá)組和高表達(dá)組的生存曲線差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.547，P=0.033)，IDO1低表達(dá)組中位生存期(42.1個月)較高表達(dá)組的中位生存期(18.9個月)更長(圖1)。

圖1 2組食管癌患者的生存曲線

2.2犬尿酸對間皮素CAR-T細(xì)胞表面分子和細(xì)胞內(nèi)因子分泌的影響見表1。由表1可知，與對照組相比，犬尿酸處理組間皮素CAR-T細(xì)胞表面抑制性分子PD-1表達(dá)上調(diào)，而激活性分子CD28的表達(dá)下降，細(xì)胞內(nèi)因子IL-2和IFN-γ分泌減少。

表1 2組間皮素CAR-T細(xì)胞表面分子和細(xì)胞內(nèi)因子水平的比較(n=3)

2.3犬尿酸對間皮素CAR-T細(xì)胞殺傷能力的影響見表2。由表2可知，與對照組比較犬尿酸處理組間皮素CAR-T細(xì)胞殺傷功能標(biāo)志物CD107a表達(dá)降低KYSE510細(xì)胞凋亡率降低。

表2 犬尿酸對間皮素CAR-T細(xì)胞殺傷能力的影響(n=3)

3 討論

間皮素CAR-T細(xì)胞治療已經(jīng)在多種實(shí)體瘤中開展了多項臨床試驗(yàn)，在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，間皮素CAR-T細(xì)胞治療都顯示出良好的安全性和可行性[12]，但是卻并未像血液系統(tǒng)腫瘤一樣，展現(xiàn)出良好的治療效果。CAR-T細(xì)胞治療血液系統(tǒng)腫瘤效果較好的一個重要原因是CAR-T細(xì)胞發(fā)揮治療作用的部位是患者體內(nèi)的淋巴和血管，這些部位都是血液細(xì)胞經(jīng)常所處的環(huán)境，有足夠的資源供它們存活和攻擊腫瘤細(xì)胞。然而，許多實(shí)體瘤所處的微環(huán)境比較復(fù)雜，并且容易形成免疫抑制的微環(huán)境，抑制CAR-T細(xì)胞的功能，不利于CAR-T細(xì)胞發(fā)揮作用[13]。在殺傷性細(xì)胞的胞漿里有很多溶細(xì)胞顆粒(如CD107a)，當(dāng)殺傷細(xì)胞活化時，CD107a會被釋放到細(xì)胞接觸面，促使靶細(xì)胞死亡；因此，檢測間皮素CAR-T細(xì)胞表面的CD107a可以反映其殺傷能力。本研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌組織中免疫抑制分子IDO1 表達(dá)水平增高，并且IDO1表達(dá)水平越高，食管癌患者的預(yù)后越差。因此IDO1的表達(dá)可能是食管癌微環(huán)境中影響CAR-T細(xì)胞治療的一個重要因素。

有研究報道，在腫瘤微環(huán)境中，多種細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)IDO1的表達(dá)，如IFN-γ[14]、IL-1和TNF-α等[15]。在實(shí)體瘤治療過程中，CAR-T細(xì)胞釋放大量的IFN-γ來發(fā)揮殺傷腫瘤的作用，而由于腫瘤負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的存在，腫瘤組織中 IDO1表達(dá)明顯上調(diào)來逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。研究[16]顯示，EGFR CAR-T細(xì)胞治療的腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)患者中，許多免疫抑制分子高表達(dá)，特別是IDO1和FoxP3，也有部分患者IL-10、PD-L1和TGF-β表達(dá)較高。另有研究顯示IDO1表達(dá)上調(diào)，其代謝產(chǎn)物犬尿酸也大量增加，犬尿酸可以與芳烴受體結(jié)合，從而引起一系列生物效應(yīng)，包括抑制T細(xì)胞的活性[17]，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的激活以及誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生等[18-19]。本研究結(jié)果顯示，犬尿酸可以直接抑制CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞活性和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，因此很有可能是CAR-T細(xì)胞治療過程中誘導(dǎo)的IDO1表達(dá)上調(diào)抑制了CAR-T細(xì)胞的功能。

綜上所述，IDO1在食管癌組織中的表達(dá)高于正常組織，并且其表達(dá)與腫瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)。IDO1能夠通過其代謝產(chǎn)物犬尿酸抑制間皮素CAR-T細(xì)胞的活性和殺傷腫瘤的能力，提示在間皮素CAR-T細(xì)胞治療過程中，如果可以將IDO1抑制劑與間皮素CAR-T細(xì)胞聯(lián)合使用，可能增強(qiáng)間皮素CAR-T細(xì)胞的治療效果。