高劑量葡萄糖對小鼠肌管細胞自噬表達的影響

羅勝男，蘇震，黃佩佩，陳如意，左一丹，胡菲菲

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

糖尿病患者持續(xù)高血糖狀態(tài)可引起骨骼肌萎縮，稱為糖尿病肌病[1]，臨床表現(xiàn)為肌肉量減少，肌肉無力和身體機能下降[2]。蛋白質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致肌 肉質(zhì)量和功能的下降是糖尿病管理中最具挑戰(zhàn)性的問題之一。胰島素可抑制蛋白分解并促進蛋白合成，調(diào)節(jié)機體血糖水平。1型糖尿病出現(xiàn)骨骼肌萎縮主要由胰島素缺乏引起，而2型糖尿病則是因為骨骼肌對胰島素敏感性下降，泛素-蛋白酶系統(tǒng)和自噬-溶酶體系統(tǒng)活性增高，蛋白質(zhì)代謝失衡[3]。自噬是介導(dǎo)細胞內(nèi)功能失調(diào)的細胞器和蛋白質(zhì)降解的重要分解代謝機制[4]，當(dāng)自噬被過度活化，蛋白質(zhì)被過度降解，肌纖維功能受損，最終導(dǎo)致骨骼肌萎縮。高劑量葡萄糖對骨骼肌細胞自噬穩(wěn)態(tài)的影響尚不清楚，本研究主要探索高劑量葡萄糖對骨骼肌自噬的影響，同時通過動態(tài)監(jiān)測自噬流，進一步比較高劑量葡萄糖作用不同時間自噬表達差異。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 C2C12細胞株及慢病毒：小鼠C2C12成肌細胞株購自中國科學(xué)院細胞庫，貨號GNM26，使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司）培養(yǎng)，置于37 ℃，5% CO2恒溫孵育箱中。串聯(lián)熒光標記LC3（mRFP-GFPLC3）慢病毒購自上海吉凱基因有限公司。

1.1.2 試劑：Western blot一抗包括：抗LC3B購自美國Abcam公司，抗Beclin-1購自美國Cell Signaling Technology公司，抗體稀釋度為1:2 000和1:1 000?？功?actin購自美國Cell Signaling Technology公司，抗體稀釋度為1:1 000。PCR引物包括：LC3上游引物：5’-GCCTGTCCTGGATAAGACCAA-3’和下游引物：5’-ACCATGCTGTGCTGGTTGAC-3’。Beclin-1 上游引物：5’-AACTCGCCAGGATGGTGTCT-3’和下游引物：5’-CTTGAGTCTCCGGCTGAGGT-3’。

1.2 方法

1.2.1 C2C12細胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化和實驗處理: 當(dāng)C2C12成肌細胞融合達70%～80%，更換為含2%馬血清的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，誘導(dǎo)成肌細胞分化成肌管細胞。然后分3組，分別予正常劑量（5.5 mmol/L） 和高劑量（17 mmol/L、30 mmol/L）葡萄糖濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以5.5 mmol/L組作為正常對照組。之后每2 天更換相應(yīng)葡萄糖濃度的培養(yǎng)基。6、12、24、36、48、60和72 h后分別收集細胞，提取蛋白和RNA，檢測自噬表達情況。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染：根據(jù)說明書使用串聯(lián)熒光標記LC3（mRFP-GFP-LC3）慢病毒轉(zhuǎn)染C2C12成肌細胞，感染復(fù)數(shù)（MOI）為100，轉(zhuǎn)染助劑Polybrene（購自上海吉凱基因有限公司）終濃度為5 μg/mL，轉(zhuǎn)染8 h后更換培養(yǎng)基為生長培養(yǎng)基，再培養(yǎng)72 h后進行后續(xù)實驗（參考方法1.2.1中的實驗處理）。使用4%多聚甲醛將單層肌管細胞固定于蓋玻片上，并用DAPI染料（購自北京索萊寶科技有限公司）進行細胞核染色，將蓋玻片倒扣于載玻片上，封片后用于激光共聚焦顯微鏡的觀察。

1.2.3 慢病毒原理：串聯(lián)熒光標記LC3（mRFP-GFPLC3）慢病毒結(jié)構(gòu)中，GFP信號對pH的敏感性高于RFP，在溶酶體酸性環(huán)境下發(fā)生淬滅[5]。因此，合并圖像中GFP和RFP熒光信號的共定位，呈現(xiàn)黃色熒光斑點（即GFP+/RFP+-LC3）表示自噬體。相反，只有RFP熒光信號（即GFP-/RFP+-LC3）呈現(xiàn)紅色，表示自噬溶酶體。

1.2.4 Western blot檢測：收集肌管細胞，使用含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解緩沖液（購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司）冰上裂解細胞，提取細胞蛋白，使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒（購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司）測量總蛋白量。隨后行SDS-PAGE電泳分離蛋白，并電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜4次，每次10 min，然后用山羊抗兔二抗（購自美國Biosharp公司）孵育1 h，抗體稀釋度1:2 000。再次用TBST洗膜4次，每次10 min，采用增強的化學(xué)發(fā)光試劑（購自美國Thermo公司）進行檢測，用自動掃描儀分析蛋白印跡并使用圖像分析軟件數(shù)字化定量分析條帶灰度值。

1.2.5 實時熒光定量PCR：使用TRIzol試劑（購自美國Invitrogen公司）提取總RNA，并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自美國Thermo公司）合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq II（購自日本Takara公司）在CFX Connect實時PCR檢測系統(tǒng)（購自美國Bio-Rad公司）上進行定量PCR。每個樣品均設(shè)置3個復(fù)孔，并以GAPDH作內(nèi)參進行校正。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法進行分析；培養(yǎng)時間與葡萄糖濃度的交互作用采用雙因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組不同劑量葡萄糖作用不同時間肌管細胞C2C12自噬相關(guān)蛋白和基因表達結(jié)果 3組不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)6和12 h，自噬標記蛋白LC3和Beclin-1表達水平組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見圖1。與5.5 mmol/L組比，30 mmmol/L 組培養(yǎng)24 h，LC3-II和Beclin-1蛋白水平顯著降低，并且LC3的mRNA水平也顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A。當(dāng)不同劑量的葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h，30 mmol/L組LC3、Beclin-1蛋白和基因表達較5.5 mmol/L組升高，其中，LC3-II蛋白水平較5.5 mmol/L組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2B，這與培養(yǎng)時間24 h的結(jié)果相反。30 mmol/L組培養(yǎng)48 h后LC3-II和Beclin-1 蛋白水平較5.5 mmol/L組均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3A。PCR結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，與5.5 mmol/L組相比，30 mmol/L組LC3和Beclin-1 mRNA水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3A。30 mmol/L葡萄糖濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)C2C12肌管細胞60和72 h后結(jié)果與48 h一致，自噬活性顯著高于5.5 mmol/L組，見圖3B-C。不同時間點LC3-II和Beclin-1 蛋白表達量變化規(guī)律一致，見圖4。培養(yǎng)時間與葡萄糖濃度存在交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），高劑量葡萄糖30 mmol/L組培養(yǎng)72 h，自噬蛋白表達量最高。

圖1 6 h和12 h 3組C2C12肌管細胞LC3-II和Beclin-1蛋白表達結(jié)果（n=6）

圖2 24和36 h 3組C2C12肌管細胞LC3-II和Beclin-1蛋白和mRNA表達結(jié)果（n=6）

2.2 高劑量葡萄糖作用不同時間C2C12細胞串聯(lián)熒光標記LC3表達結(jié)果 在C2C12肌管細胞的激光共聚焦顯微鏡圖像中，存在一些RFP和GFP熒光斑點，并且許多熒光斑點在合并圖像中共定位，表明存在自噬體和自噬溶酶體。隨葡萄糖濃度的升高，合并圖像中不僅黃色斑點數(shù)量明顯增加，RFP熒光斑點數(shù)量也顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。與5.5 mmol/L組比，高劑量葡萄糖30 mmol/L 組培養(yǎng)60 h和72 h后RFP和GFP熒光斑點數(shù)量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6-7。

3 討論

圖3 48、60和72 h 3組C2C12肌管細胞LC3-II和Beclin-1蛋白和mRNA表達結(jié)果（n=6）

圖4 不同時間點自噬標記蛋白表達變化趨勢線圖（n=6）

圖5 48 h激光共聚焦顯微鏡檢測LC3熒光光斑（×400，n=12）

1型和2型糖尿病均可影響骨骼肌正常代謝，導(dǎo)致肌肉質(zhì)量和力量下降，稱糖尿病肌病[6]。與糖尿病其他并發(fā)癥（如血管病、視網(wǎng)膜病、腎病和神經(jīng)病）相比，糖尿病肌病經(jīng)常被忽視且尚未被臨床診斷?；诠趋兰≡隗w內(nèi)葡萄糖代謝中的關(guān)鍵作用，糖尿病肌病還會加重其他并發(fā)癥的疾病進展。但糖尿病肌病的發(fā)生機制尚不清楚，有研究指出糖尿病會引起骨骼肌細胞的興奮-收縮耦聯(lián)機制障礙[7]，高劑量葡萄糖培養(yǎng)的肌纖維細胞表現(xiàn)為橫管形態(tài)腫脹，單一電場刺激引起動作電位誘導(dǎo)的Ca2+釋放增加。高劑量葡萄糖誘導(dǎo)的橫管結(jié)構(gòu)的破壞和Ca2+釋放改變可能在糖尿病肌病肌無力的發(fā)病機制中起到主要作用。此外，胰島素抵抗可影響蛋白質(zhì)代謝，機體高血糖和慢性炎癥狀態(tài)致細胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激、細胞器損傷以及自噬過度活化[8]，加速機體蛋白質(zhì)的消耗[9]。

圖6 60 h激光共聚焦顯微鏡檢測LC3熒光光斑（×400，n=12）

圖7 72 h激光共聚焦顯微鏡檢測LC3熒光光斑（×400，n=12）

自噬-溶酶體系統(tǒng)是細胞內(nèi)主要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，對于細胞更新和體內(nèi)代謝平衡至關(guān)重要[10]，在維持肌肉質(zhì)量和肌纖維穩(wěn)態(tài)方面也發(fā)揮著重要作用[11-12]。在骨骼肌中，自噬囊泡將衰老的細胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至溶酶體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，然后囊泡內(nèi)的物質(zhì)被降解產(chǎn)生氨基酸、核苷酸、葡萄糖和脂肪酸用于細胞物質(zhì)合 成[11，13]。近年來，自噬-溶酶體系統(tǒng)過度活化已被證實可引起蛋白質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致骨骼肌萎縮[14]。某些疾病狀態(tài)下引起的骨骼肌萎縮，包括饑餓、衰老[15]、膿毒血癥[16]、慢性腎功能不全[17]和癌癥[18]等，均與自噬過度活化有關(guān)。營養(yǎng)缺乏自噬因子-1（nutrient deficiency autophagy factor-1，Naf-1） 是自噬調(diào)節(jié)因子，在Naf-1基因敲除小鼠中，骨骼肌結(jié)構(gòu)和性能因自噬增強而顯著受損[19]。因此，自噬穩(wěn)態(tài)是保持肌肉質(zhì)量和功能所必需的[20]。

當(dāng)自噬微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3-I）轉(zhuǎn)化為 LC3-II并融入自噬泡時，就提示形成了成熟的自 噬[21]。同時，Beclin-1的募集是自噬起始的信號，可以調(diào)節(jié)自噬上游[22]。因此，LC3-II和Beclin-1 蛋白表達水平與自噬體的數(shù)量成比例。本研究使用這2種自噬蛋白和自噬標記基因來評估細胞外高劑量葡萄糖對C2C12肌管細胞自噬的影響，結(jié)果表明細胞外高劑量葡萄糖可破壞肌管細胞自噬穩(wěn)態(tài)。另外，還發(fā)現(xiàn)不同的培養(yǎng)時間具有不同的自噬通量。早期階段，當(dāng)高劑量葡萄糖培養(yǎng)C2C12肌管細胞24 h，與 5.5 mmol/L組比，自噬標記基因和蛋白表達均被顯著抑制，這與之前的報道[23]一致。3種葡萄糖濃度的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)肌管細胞48、60和72 h，Western bolt和PCR結(jié)果分析均顯示高劑量葡萄糖30 mmol/L 組自噬體合成顯著增加。

自噬是一個動態(tài)多步驟的過程，自噬體的積累可能表明自噬生成增加或自噬體清除減少。自噬標記物如LC3-II和Beclin-1 的分析，只能近似估計自噬通量。為進一步探討細胞外高劑量葡萄糖對骨骼肌細胞自噬通量的影響，本研究采用了串聯(lián)熒光標記LC3（mRFP-GFP-LC3）慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C2C12成肌細胞，動態(tài)監(jiān)測自噬體成熟過程[5]。肌管細胞RFP和GFP熒光斑點的定量分析顯示，高劑量葡萄糖培養(yǎng)48、60和72 h后，自噬體和自噬溶酶體均顯著增加。結(jié)果表明，長時間高濃度葡萄糖環(huán)境下培養(yǎng)C2C12肌管細胞可誘導(dǎo)自噬過度活化，且高劑量葡萄糖對肌管細胞自噬的作用與培養(yǎng)時間相關(guān)。

本研究在不同時間評估高血糖對骨骼肌細胞自噬作用的重要性，從而推測，糖尿病患者骨骼肌萎縮的觸發(fā)事件可能是自噬-溶酶體系統(tǒng)被過度激活、機體蛋白質(zhì)降解增加、長期高血糖狀態(tài)最終導(dǎo)致糖尿病肌病。