硼對(duì)大鼠肝臟顯微結(jié)構(gòu)、肝糖原含量、抗氧化功能及細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

丁永旺 任 曼 趙春芳 顧有方,2 靳二輝,2* 李升和,2*

(1.安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，鳳陽(yáng)233100；2.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鳳陽(yáng)233100)

硼是自然界中廣泛存在的一種非金屬元素，兼有金屬元素性質(zhì)，通常以硼酸或硼酸鹽形態(tài)存在于土壤、水和巖石中。研究表明，硼是人和動(dòng)物不可缺少的微量元素之一，可促進(jìn)礦物質(zhì)代謝、能量代謝、大腦功能和免疫反應(yīng)，降低關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)，并參與降低某些癌癥發(fā)生率[1-4]。硼攝入不足會(huì)導(dǎo)致骨骼發(fā)育、大腦反應(yīng)和免疫功能受損[5]。在培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中，降低硼含量可誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶激活，敲除硼離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖受到抑制[6]。研究發(fā)現(xiàn)，適量補(bǔ)充硼能夠改善許多代謝酶活性，調(diào)節(jié)動(dòng)物骨骼發(fā)育及礦物質(zhì)和能量代謝，增強(qiáng)抗氧化功能和免疫功能，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分化，降低血清甘油三酯含量[7-9]。添加低劑量(0.01～0.10 mmol/L)硼可促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，抑制鴕鳥(niǎo)脾臟淋巴細(xì)胞凋亡，而添加高劑量(25～100 mmol/L)硼則產(chǎn)生相反的作用[10]。經(jīng)口灌胃100 mg/kg硼酸能夠顯著升高乙醇誘導(dǎo)的肝臟超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性減低，減少肝臟丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和半胱天冬蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，從而減弱乙醇誘導(dǎo)的肝臟氧化損傷[11]。飲水補(bǔ)充100 mg/L硼對(duì)肉雞免疫器官(脾臟和胸腺)發(fā)育和顯微結(jié)構(gòu)改善均可產(chǎn)生積極影響[12]。但是，高劑量硼對(duì)人和動(dòng)物機(jī)體可產(chǎn)生不良影響，甚至具有一定毒性作用。有研究發(fā)現(xiàn)，飲水補(bǔ)充640 mg/L硼導(dǎo)致大鼠抗氧化能力明顯下降，機(jī)體膽固醇、脂類、糖類及離子代謝發(fā)生紊亂[13]。

以上研究表明，不同劑量硼可對(duì)動(dòng)物機(jī)體多種生理功能產(chǎn)生不同影響，但其作用機(jī)制尚不清楚。肝臟是動(dòng)物機(jī)體最大的消化腺，在維持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和代謝、有毒物質(zhì)降解及免疫調(diào)節(jié)等方面起著至關(guān)重要的作用，肝臟顯微結(jié)構(gòu)和生理功能改變可直接影響動(dòng)物機(jī)體消化功能和免疫功能。然而，不同劑量硼對(duì)哺乳動(dòng)物肝臟顯微結(jié)構(gòu)、抗氧化功能和細(xì)胞增殖和凋亡產(chǎn)生何種影響并不清楚。因此，本研究以大鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，研究不同劑量硼對(duì)肝臟顯微結(jié)構(gòu)、肝糖原含量、抗氧化功能及細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，為揭示硼影響動(dòng)物生理功能的作用機(jī)制及其在人和動(dòng)物生活生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1 試驗(yàn)材料

SD大鼠購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-001。硼酸(H3BO3)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120524，分析純，純度≥99.5%，硼含量≥17.4%。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用清潔級(jí)剛斷乳的(22±2)日齡健康雄性SD大鼠100只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為10組，每組10只。對(duì)照組飲用蒸餾水(硼含量為0)，試驗(yàn)組(Ⅰ～Ⅸ組)分別飲用硼含量為5、10、20、40、80、160、320、480、640 mg/L的蒸餾水。試驗(yàn)期60 d。所有試驗(yàn)大鼠均飼喂普通大鼠基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。動(dòng)物使用由安徽科技學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)，所有試驗(yàn)程序均嚴(yán)格按照安徽省《試驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。動(dòng)物飼養(yǎng)在安徽科技學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物房大鼠獨(dú)立通氣籠盒(individually ventilated cages，IVC)內(nèi)，室溫控制在22～25 ℃，相對(duì)濕度控制在50%～60%，給予14 h光照10 h黑暗光照周期，自由采食和飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)前所有籠子、蓋子和水瓶均進(jìn)行消毒處理。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠禁食不禁水過(guò)夜，稱重，右心房采血并放血處死，迅速分離肝臟，一部分固定于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中用于蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，一部分固定于卡諾(Carnoy)固定液中用于肝糖原過(guò)碘酸希夫反應(yīng)(periodic acid-Schiff，PAS)染色，另一部分經(jīng)液氮冷凍后于-80 ℃保存用于抗氧化指標(biāo)測(cè)定及總RNA提取。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 肝臟組織學(xué)觀察

大鼠肝臟經(jīng)4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液充分固定后，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、石蠟輪轉(zhuǎn)切片機(jī)切片(厚6 μm)，每10張切片取1片用于HE染色，方法參照J(rèn)in等[14]。染色結(jié)果使用全自動(dòng)數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)[VM1，麥克奧迪(廈門(mén))醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司]進(jìn)行觀察并拍照。

1.3.2 PAS染色分析

大鼠肝臟經(jīng)卡諾固定液充分固定后，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、石蠟輪轉(zhuǎn)切片機(jī)切片(厚6 μm)，每10張切片取1片用于PAS染色。肝臟切片脫蠟至水，在1%過(guò)碘酸水溶液中氯化5 min，流水沖洗5 min，再用蒸餾水漂洗，加入Schiff試劑中反應(yīng)15 min，亞硫酸鈉溶液洗滌3次(每次2 min)，流水沖洗10 min，蘇木精對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色后進(jìn)行脫水透明，中性樹(shù)膠封片。使用全自動(dòng)數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍照。每個(gè)肝臟組織取5張肝臟切片進(jìn)行PAS染色，每張PAS染色切片按照上、下、左、右、中的順序選取5個(gè)視野拍照，然后用Image Pro Plus 6.0測(cè)定PAS染色的積分光密度值(integral optical density value)。

1.3.3 抗氧化功能測(cè)定

采用試劑盒測(cè)定肝臟組織勻漿中MDA含量和SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性以及總抗氧化能力(T-AOC)，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定

參考屈勝勝[15]報(bào)道方法進(jìn)行大鼠肝臟組織總RNA提取。用NanoDrop One超微量核酸蛋白測(cè)定儀(Thermo公司，美國(guó))檢測(cè)提取的肝臟總RNA的濃度和質(zhì)量，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司，美國(guó))操作說(shuō)明合成第1條cDNA鏈。實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定方法參考Liu等[16]的報(bào)道，并按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司，日本)操作說(shuō)明進(jìn)行核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)、依賴還原型輔酶Ⅰ(Ⅱ)醌氧化還原酶1[NAD(P)H:quinine oxidoreductase 1，NQO1]、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、Caspase-3、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(B-cell lymphoma/leukaemia-2-associated X protein，Bax)和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukaemia-2，Bcl-2)mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3次，測(cè)定儀器為480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀(Roche公司，瑞士)。引物序列如表2所示，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參基因，測(cè)定結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表2 引物序列

續(xù)表2基因Genes登錄號(hào)Accession number引物序列Primer sequence (5'—3')產(chǎn)物長(zhǎng)度Product length/bp退火溫度Tm/℃依賴還原型輔酶Ⅰ(Ⅱ)醌氧化還原酶1NQO1NM_017000.3F:GCTTGTAGCAGGATTCGCCTR:ATGACGTTCATGTCCCCGTG144593-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDHNM_017008.4F:GGCAAGTTCAACGGCACAGR:CCCGTAGTCGCCTTCCCCG23260

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)定數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，不同試驗(yàn)組之間差異顯著性采用Duncan氏法進(jìn)行檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05為顯著差異，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飲水補(bǔ)充不同劑量硼對(duì)大鼠肝臟顯微結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，對(duì)照組大鼠肝臟顯微結(jié)構(gòu)正常，肝小葉輪廓清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，肝血竇寬窄適當(dāng)，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，肝枯否氏細(xì)胞數(shù)量適中(圖1-A)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組大鼠肝臟顯微結(jié)構(gòu)明顯改善，肝細(xì)胞索排列更加整齊，肝血竇變窄，肝細(xì)胞增大，雙核肝細(xì)胞數(shù)量增多，枯否氏細(xì)胞數(shù)量有所增多，其中試驗(yàn)Ⅲ組肝臟中靠近中央靜脈周?chē)母渭?xì)胞中出現(xiàn)少量的脂滴(圖1-B、圖1-C和圖1-D)。試驗(yàn)Ⅳ組大鼠肝細(xì)胞索排列稍顯紊亂，肝血竇變窄，肝細(xì)胞核染色較深，肝枯否氏細(xì)胞增多，中央靜脈周?chē)母渭?xì)胞中脂滴增多(圖1-E)。試驗(yàn)Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ組大鼠肝臟顯微結(jié)構(gòu)有所損傷，肝小葉輪廓不清，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝血竇增寬，雙核肝細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，肝細(xì)胞染色逐漸加深，肝枯否氏細(xì)胞逐漸增加，含有脂滴的肝細(xì)胞數(shù)量和分布明顯增加(圖1-F、圖1-G和圖1-H)。試驗(yàn)Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟明顯受損，肝小葉輪廓模糊，肝細(xì)胞索排列非常紊亂，肝血竇顯著增寬，肝細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)溶解，肝枯否氏細(xì)胞顯著增加，并在局部出現(xiàn)聚集，肝細(xì)胞中脂滴數(shù)量顯著增加，部分肝細(xì)胞中出現(xiàn)較大的空泡樣結(jié)構(gòu)(圖1-I和圖1-J)。

A：對(duì)照組；B：試驗(yàn)Ⅰ組；C：試驗(yàn)Ⅱ組；D：試驗(yàn)Ⅲ組；E：試驗(yàn)Ⅳ組；F：試驗(yàn)Ⅴ組；G：試驗(yàn)Ⅵ組；H：試驗(yàn)Ⅶ組；I：試驗(yàn)Ⅷ組；J：試驗(yàn)Ⅸ組。圖2同。

2.2 飲水補(bǔ)充同劑量硼對(duì)大鼠肝臟中肝糖原分布和含量的影響

由圖2可知，大鼠肝臟中肝糖原PAS染色陽(yáng)性細(xì)胞中可見(jiàn)粉紅色或者淡紅色顆粒，主要分布在中央靜脈周?chē)?。?duì)照組肝臟中可見(jiàn)少量的PAS染色陽(yáng)性細(xì)胞，主要分布在中央靜脈周?chē)?圖2-A)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組大鼠肝臟中PAS染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，分布增加，主要分布在中央靜脈周?chē)安糠指涡∪~邊緣(圖2-B)。試驗(yàn)Ⅱ組大鼠肝臟中PAS染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，PAS陽(yáng)性反應(yīng)增強(qiáng)，分布區(qū)域明顯增大，中央靜脈和肝肝小葉邊緣均分布有較多的PAS染色陽(yáng)性細(xì)胞(圖2-C)。試驗(yàn)Ⅲ和Ⅳ組大鼠肝臟PAS染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和分布無(wú)明顯差異(圖2-D和2-E)。然而，試驗(yàn)Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟中PAS染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，陽(yáng)性染色較淡，幾乎看不見(jiàn)PAS染色陽(yáng)性細(xì)胞(圖2-F、圖2-G、圖2-H、圖2-I和圖2-J)。

圖2 飲水補(bǔ)充不同劑量硼對(duì)大鼠肝臟PAS染色的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組大鼠肝臟中肝糖原含量分別極顯著增加了20.21%和37.52%(P<0.01)，而試驗(yàn)Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟中肝糖原含量分別極顯著降低了17.99%、22.53%、15.47%、55.42%和64.41%(P<0.01)，但試驗(yàn)Ⅲ和Ⅳ組大鼠肝臟中肝糖原含量無(wú)顯著變化(P>0.05)。

與對(duì)照組相比，數(shù)據(jù)柱標(biāo)*表示差異顯著(P<0.05)，數(shù)據(jù)柱標(biāo)**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.3 飲水補(bǔ)充不同劑量硼對(duì)大鼠肝臟抗氧化功能的影響

由圖4可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組大鼠肝臟SOD活性分別顯著或極顯著提高了48.20%和64.66%(P<0.05或P<0.01)，其余各組大鼠肝臟SOD活性差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組大鼠肝臟T-AOC分別顯著提高了24.86%和28.03%(P<0.05)，試驗(yàn)Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟T-AOC分別顯著或極顯著下降了27.14%和58.08%(P<0.05或P<0.01)，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ組大鼠肝臟T-AOC差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)Ⅰ組大鼠肝臟GSH-Px活性極顯著提高了39.60%(P<0.01)，其余各組大鼠肝臟GSH-Px活性差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟MDA含量顯著或極顯著提高了49.30%和73.06%(P<0.05或P<0.01)，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ組大鼠肝臟MDA含量差異不顯著(P>0.05)。

圖4 飲水補(bǔ)充不同劑量硼對(duì)大鼠肝臟抗氧化功能的影響

由圖5可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組大鼠肝臟Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別顯著提高了32.00%和26.67%(P<0.05)，而試驗(yàn)Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別顯著或極顯著降低了34.67%和50.67%(P<0.05或P<0.01)，其余各組大鼠肝臟Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)Ⅰ組大鼠肝臟NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高了26.87%(P<0.05)，而試驗(yàn)Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別顯著或極顯著降低了38.81%和53.73%(P<0.05或P<0.01)，其余各組大鼠肝臟NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

圖5 飲水補(bǔ)充不同劑量硼對(duì)大鼠肝臟Nrf2(A)和NQO1(B)mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4 飲水補(bǔ)充不同劑量硼對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖6可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組大鼠肝臟PCNAmRNA相對(duì)表達(dá)量分別極顯著提高了25.16%和35.04%(P<0.01)，而試驗(yàn)Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟PCNAmRNA相對(duì)表達(dá)量分別極顯著降低了29.52%、42.23%、57.45%、57.00%、61.17%和63.29%(P<0.01)，試驗(yàn)Ⅲ組大鼠肝臟PCNAmRNA相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別顯著或極顯著提高了44.51%、39.86%、57.57%和65.82%(P<0.05或P<0.01)，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組大鼠肝臟Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)Ⅱ組大鼠肝臟BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低了12.07%(P<0.05)，而試驗(yàn)Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量分別顯著或極顯著提高了16.72%、22.29%、30.65%和31.58%(P<0.05或P<0.01)，其余各組大鼠肝臟BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)Ⅱ組大鼠肝臟Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高了14.48%(P<0.05)，而試驗(yàn)Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別顯著或極顯著降低了14.47%、22.56%、14.76%、32.31%和34.54%(P<0.05或P<0.01)，其余各組大鼠肝臟Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

圖6 飲水補(bǔ)充不同劑量硼對(duì)大鼠肝臟PCNA(A)、Caspase-3(B)、Bax(C)和Bcl-2(D)mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 飲水補(bǔ)充不同劑量硼對(duì)大鼠肝臟顯微結(jié)構(gòu)和肝糖原含量的影響

肝臟作為動(dòng)物機(jī)體重要的消化器官，具有消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能，還負(fù)責(zé)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝和利用以及合成機(jī)體必需的大分子物質(zhì)。更重要的是，肝臟還具有解毒、參與免疫及造血作用，是動(dòng)物機(jī)體非常重要的多功能器官之一。肝臟多種功能的發(fā)揮與其組織結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，肝臟組織結(jié)構(gòu)是肝臟功能正常發(fā)揮的基礎(chǔ)，肝臟顯微結(jié)構(gòu)的改變直接影響肝臟的功能狀況。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充不同劑量硼能夠?qū)?dòng)物許多器官的顯微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[17-18]。王為等[19]對(duì)非洲鴕鳥(niǎo)研究發(fā)現(xiàn)，飲水補(bǔ)充80 mg/L硼有利于肝臟發(fā)育，可改善肝臟組織結(jié)構(gòu)，使肝血竇內(nèi)枯否氏細(xì)胞增多，肝血竇增大，而飲水補(bǔ)充320和640 mg/L硼則對(duì)非洲雛鴕鳥(niǎo)肝臟發(fā)育產(chǎn)生損傷影響，導(dǎo)致肝臟組織出現(xiàn)明顯病理學(xué)變化，肝板排列混亂，細(xì)胞與細(xì)胞間分界模糊，細(xì)胞核出現(xiàn)碎裂或固縮，肝血竇狹小。諸亞平等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飲水補(bǔ)充100 mg/L硼對(duì)固始雞發(fā)育后期(3～6周齡)肝臟組織結(jié)構(gòu)有明顯改善和促進(jìn)作用，而飲水補(bǔ)充大于200 mg/L硼則對(duì)固始雞肝臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)育有明顯不良影響。本研究也發(fā)現(xiàn)，飲水補(bǔ)充5～20 mg/L硼可明顯改善大鼠肝臟顯微結(jié)構(gòu)，肝小葉輪廓更加清晰，肝細(xì)胞索排列更加整齊，肝血竇變窄，雙核肝細(xì)胞數(shù)量增多，肝枯否氏細(xì)胞數(shù)量增加，表明飲水補(bǔ)充適量硼對(duì)哺乳動(dòng)物肝臟顯微結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生明顯改善作用，進(jìn)而促進(jìn)肝臟發(fā)育，增強(qiáng)肝臟功能。然而，飲水補(bǔ)充480和640 mg/L硼則導(dǎo)致大鼠肝臟顯微結(jié)構(gòu)受損，出現(xiàn)明顯的脂肪沉淀、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及肝細(xì)胞溶解，進(jìn)而損傷肝細(xì)胞功能。其原因可能是適量的補(bǔ)充硼可以促進(jìn)腸道組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育，從而增強(qiáng)胃腸吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，為肝細(xì)胞生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)需要。然而，補(bǔ)充高劑量的硼則損害腸道顯微結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重影響腸道消化吸收功能[18]，進(jìn)而影響大鼠肝臟的發(fā)育。

糖原是動(dòng)物機(jī)體重要的能量來(lái)源，主要分為肝糖原和肌糖原，動(dòng)物消化器官吸收的糖類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被利用后，多余的分別被肝細(xì)胞和肌細(xì)胞合成為肝糖原和肌糖原。肝臟是肝糖原的主要儲(chǔ)藏庫(kù)，用于維持動(dòng)物機(jī)體的血糖水平。肝糖原含量的變化可以直接反映肝臟功能，肝糖原含量降低則可能導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體出現(xiàn)低血糖癥狀[21]。研究表明，補(bǔ)充不同劑量硼可對(duì)動(dòng)物肝糖原含量產(chǎn)生明顯影響。哈西卜哈利克[22]研究發(fā)現(xiàn)，飲水補(bǔ)充80 mg/L硼能夠顯著增加非洲鴕鳥(niǎo)肝臟中肝糖原含量，而飲水補(bǔ)充640 mg/L硼則顯著降低肝糖原含量。有研究報(bào)道，補(bǔ)充20和40 mg/L硼可使肥胖大鼠肝細(xì)胞內(nèi)肝糖原含量明顯增多，而補(bǔ)充80 mg/L硼導(dǎo)致肥胖大鼠肝臟PAS染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，飲水補(bǔ)充5和10 mg/L硼可顯著增加PAS染色陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和分布，增強(qiáng)PAS染色，而飲水補(bǔ)充480和640 mg/L硼則導(dǎo)致PAS染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少。這表明適量補(bǔ)充硼能夠適當(dāng)促進(jìn)肝糖原合成儲(chǔ)存，而補(bǔ)充高劑量硼則導(dǎo)致肝糖原含量顯著減少，分析原因可能包括以下2方面：一方面，高劑量硼導(dǎo)致大鼠肝臟內(nèi)硼含量增多，造成肝細(xì)胞出現(xiàn)硼中毒，進(jìn)而引起肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，肝糖原合成儲(chǔ)存功能受到抑制；另一方面，高劑量硼引起動(dòng)物機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，加快了機(jī)體對(duì)肝臟中肝糖原的利用，進(jìn)而導(dǎo)致肝糖原含量減少[22]。另外，Javed等[24]研究發(fā)現(xiàn)，金屬中毒后導(dǎo)致動(dòng)物糖原儲(chǔ)備減少，而硼兼具有金屬性質(zhì)，很可能過(guò)多的硼在動(dòng)物肝臟內(nèi)積累會(huì)產(chǎn)生同樣效果。

3.2 飲水補(bǔ)充不同劑量硼對(duì)大鼠肝臟抗氧化功能的影響

氧自由基是動(dòng)物機(jī)體有氧呼吸過(guò)程中產(chǎn)生的物質(zhì)，當(dāng)機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí)，氧自由基產(chǎn)生與消除呈現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)平衡，而當(dāng)機(jī)體健康狀況出現(xiàn)異常時(shí)，這種平衡被打破，大量氧自由基產(chǎn)生不能被消除，進(jìn)而損害細(xì)胞結(jié)構(gòu)。動(dòng)物機(jī)體清除氧自由基主要由抗氧化系統(tǒng)來(lái)完成。機(jī)體抗氧化系統(tǒng)主要由抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)組成[25]。其中，SOD和GSH-Px是動(dòng)物體內(nèi)2種重要的抗氧化酶[26]，SOD和GSH-Px活性高低可以間接反映機(jī)體清除自由基能力[27]。T-AOC是反映器官組織整個(gè)抗氧化能力的一個(gè)重要指標(biāo)[28]，而MDA含量是機(jī)體氧化反應(yīng)中主要代謝產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞膜可產(chǎn)生損傷作用，其含量間接反映器官組織氧化程度[29]。此外，Nrf2在機(jī)體清除氧自由基的復(fù)雜系統(tǒng)中起著重要作用，其可通過(guò)調(diào)控部分抗氧化酶基因表達(dá)而發(fā)揮抗氧化作用。NQO1是Nrf2基因調(diào)控的下游基因之一，NQO1通過(guò)維持泛醌和α-生育酚醌的還原形式，在保護(hù)內(nèi)源性抗氧化劑中起關(guān)鍵作用[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，飲水補(bǔ)充40 mg/L硼可提高脾臟抗氧化能力，改善脾臟組織結(jié)構(gòu)；而飲水補(bǔ)充大于80 mg/L硼可降低脾臟抗氧化能力，破壞脾臟組織結(jié)構(gòu)[17]。也有研究顯示，飲水補(bǔ)充10和20 mg/L硼可增加大鼠胸腺GSH-Px活性，顯著提高胸腺SOD活性和T-AOC，降低胸腺M(fèi)DA含量，而飲水補(bǔ)充480和640 mg/L硼則對(duì)大鼠胸腺中這4個(gè)指標(biāo)產(chǎn)生了相反影響[31]。Yamada等[32]研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L硼酸處理可以激活DU-145前列腺癌細(xì)胞Nrf2基因并增加NQO1基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飲水補(bǔ)充5 mg/L硼可增加大鼠肝臟SOD、GSH-Px活性和T-AOC，提高Nrf2和NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)量；飲水補(bǔ)充10 mg/L硼也能增加大鼠肝臟SOD活性和T-AOC，提高Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。這表明飲水中添加5和10 mg/L硼可提升大鼠肝臟抗氧化酶活性，提高大鼠肝臟抗氧化功能。然而，飲水補(bǔ)充480和640 mg/L硼則降低大鼠肝臟SOD、GSH-Px活性和T-AOC，并降低Nrf2和NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，從而降低機(jī)體清除自由基的能力，使MDA含量增加。分析硼影響抗氧化功能的原因可能是：硼可以通過(guò)硼酸核受體介導(dǎo)，刺激轉(zhuǎn)錄因子激活，調(diào)節(jié)活性氧清除相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用[33]；也可能是硼對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激的抑制作用和對(duì)酶活性的抑制作用[34]。硼的抗氧化作用與微量元素硒的抗氧化功能有所不同，硒的抗氧化功能主要體現(xiàn)在硒以硒半胱氨酸和硒蛋氨酸2種形式存在于硒蛋白中，而硒蛋白參與動(dòng)物機(jī)體抗氧化體系的組成，調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體的自由基代謝和抗氧化酶活性，進(jìn)而影響機(jī)體抗氧化功能[35]。另外，飲水補(bǔ)充40～320 mg/L硼引起大鼠肝臟SOD和GSH-Px活性增加，這提示機(jī)體可能通過(guò)代償機(jī)制增強(qiáng)肝臟SOD和GSH-Px活性以清除多余的自由基。

3.3 飲水補(bǔ)充不同劑量硼對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

細(xì)胞增殖和凋亡是細(xì)胞正常生長(zhǎng)過(guò)程中2個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)事件，細(xì)胞通過(guò)增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡實(shí)現(xiàn)細(xì)胞功能的正常發(fā)揮。PCNA是細(xì)胞DNA聚合酶δ的輔助蛋白，其表達(dá)變化與細(xì)胞增殖狀態(tài)密切相關(guān)，可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)之一[36]。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，調(diào)控細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因通過(guò)接受細(xì)胞凋亡信號(hào)，表達(dá)和合成細(xì)胞凋亡相關(guān)的各種酶，誘導(dǎo)產(chǎn)生聯(lián)級(jí)反應(yīng)進(jìn)而完成凋亡事件。Caspase-3是執(zhí)行細(xì)胞凋亡最后程序的關(guān)鍵酶，其基因表達(dá)變化可以在一定程度上反映細(xì)胞凋亡狀態(tài)[37]，Bcl-2蛋白家族是一類在細(xì)胞凋亡中起重要作用的蛋白，它們主要參與線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑，其成員Bax與Bcl-2這一對(duì)相互拮抗的基因共同調(diào)控細(xì)胞凋亡事件，它們的表達(dá)變化可以反映細(xì)胞的凋亡狀態(tài)[38]。有研究報(bào)道，在培養(yǎng)液中加入0.4 mmol/L的硼可以促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖和Bcl-2 mRNA表達(dá)，而加入40 mmol/L的硼則可以促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的凋亡和BaxmRNA表達(dá)[39]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，飲水補(bǔ)充80 mg/L硼可使非洲鴕鳥(niǎo)腸細(xì)胞凋亡顯著減少，而飲水補(bǔ)充320和640 mg/L硼可使非洲鴕鳥(niǎo)腸細(xì)胞凋亡顯著增加[40]。本研究也發(fā)現(xiàn)，飲水補(bǔ)充5和10 mg/L硼可增加大鼠肝臟PCNA和Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量，降低Caspase-3和BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量；而飲水補(bǔ)充480和640 mg/L硼則降低大鼠肝臟PCNA和Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量，增加Caspase-3和BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量。這可能是由于適量補(bǔ)充硼可能通過(guò)減少含重復(fù)凋亡結(jié)構(gòu)桿狀病毒抑制劑(BIRC)2/3表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)受體相互作用蛋白1(RIP1)泛素化，減少琥珀酸脫氫酶形成，從而抑制細(xì)胞死亡，而高濃度硼產(chǎn)生了相反作用[10]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，飲水補(bǔ)充5和10 mg/L硼就能夠明顯促進(jìn)大鼠肝臟PCNAmRNA表達(dá)，抑制Caspase-3 mRNA表達(dá)，其主要原因可能是不同器官對(duì)硼的敏感程度不一致，肝臟對(duì)硼生物學(xué)作用更加敏感。

4 結(jié) 論

飲水補(bǔ)充5和10 mg/L硼可改善大鼠肝臟顯微結(jié)構(gòu)，增加肝糖原含量，提高肝臟SOD、GSH-Px活性和T-AOC，降低肝臟MDA含量，促進(jìn)肝臟Nrf2和PCNAmRNA表達(dá)；而飲水補(bǔ)充480和640 mg/L硼則產(chǎn)生相反作用。