小鼠卵巢顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及對(duì)沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1信號(hào)通路的影響

弓浩杰 丁雪梅 白世平 曾秋鳳 張克英 王建萍

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)與飼料農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130)

卵巢是雌性動(dòng)物極其重要且獨(dú)特的器官，卵巢的質(zhì)量將決定動(dòng)物的繁殖能力和生產(chǎn)性能。在卵泡發(fā)育成熟并排卵的過(guò)程中，絕大多數(shù)卵泡都會(huì)在發(fā)育過(guò)程中閉鎖消失，而只有極少數(shù)卵泡能順利發(fā)育至成熟排卵[1-3]。卵泡及其中的卵母細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中停止生長(zhǎng)并逐漸退化、消失的現(xiàn)象稱為卵泡閉鎖。哺乳動(dòng)物在出生前或剛出生時(shí)，卵巢內(nèi)的卵原細(xì)胞發(fā)育成原始卵泡，在卵泡周圍包圍著一層扁平顆粒細(xì)胞[4]，顆粒細(xì)胞緊密包裹在卵母細(xì)胞外，為卵母細(xì)胞發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)和促成熟因子，對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟至關(guān)重要。已有研究表明，顆粒細(xì)胞數(shù)量減少會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡，卵巢功能下降[5-6]。隨著近年來(lái)對(duì)細(xì)胞凋亡的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的主要原因[7]。

引起卵泡閉鎖的原因主要包括生理因素和環(huán)境因素，體內(nèi)外的刺激會(huì)對(duì)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育造成損傷，并且導(dǎo)致卵泡內(nèi)微環(huán)境中活性氧(reactive oxygen species，ROS)自由基過(guò)量產(chǎn)生，打破氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，造成氧化應(yīng)激[8]。有大量文獻(xiàn)報(bào)道，氧化應(yīng)激能夠誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡導(dǎo)致卵泡閉鎖[9-11]。李烈川等[12]研究發(fā)現(xiàn)，使用過(guò)氧化氫(H2O2)處理體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細(xì)胞后，促凋亡基因的表達(dá)顯著提高，細(xì)胞凋亡率顯著提高。此外，申明[13]研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞(mouse ovarian granulosa cells，MOGC)凋亡率和ROS水平顯著高于對(duì)照組，凋亡相關(guān)基因——腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、凋亡相關(guān)因子配體(FasL)和B細(xì)胞淋巴瘤2相互作用的細(xì)胞死亡中介物(Bim)mRNA的表達(dá)量顯著提高。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(SIRT1)是生命體中廣泛存在的一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的進(jìn)化上高度保守的去乙?；福歉惺軝C(jī)體氧化還原狀態(tài)的關(guān)鍵蛋白之一。已有研究證實(shí)，SIRT1參與糖脂代謝、炎癥、細(xì)胞衰老以及細(xì)胞凋亡等生理活動(dòng)[14]，是參與細(xì)胞氧化應(yīng)激的關(guān)鍵信號(hào)分子[15]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在人卵巢顆粒細(xì)胞增殖和保持顆粒細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等調(diào)節(jié)卵巢功能方面發(fā)揮重要作用[16-17]，并且有報(bào)道稱SIRT1在卵巢組織中高度表達(dá)，SIRT1基因表達(dá)量提高會(huì)導(dǎo)致閉鎖卵泡數(shù)量降低[18]，但目前有關(guān)SIRT1在卵巢顆粒細(xì)胞氧化損傷中的相關(guān)研究較少，還有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)通過(guò)使用H2O2處理MOGC，建立MOGC體外氧化應(yīng)激模型，測(cè)定相關(guān)的氧化應(yīng)激指標(biāo)，并探究氧化應(yīng)激對(duì)MOGC中SIRT1及其下游信號(hào)分子的影響，進(jìn)一步完善卵泡閉鎖的分子機(jī)理，為保護(hù)顆粒細(xì)胞免于氧化應(yīng)激損傷、維持卵泡正常發(fā)育、提高母畜的繁殖能力和治療人類生殖疾病提供新的研究依據(jù)和解決對(duì)策。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

試驗(yàn)試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)、澳洲胎牛血清(Gibco)、青-鏈霉素(Gibco)、胰蛋白酶(Gibco)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS，Gibco)、RIPA裂解液(碧云天)、二甲亞砜(DMSO，碧云天)、3% H2O2(Sigma)、膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ，BD Pharmingen)、碘化嘧啶(PI，BD Pharmingen)、ROS熒光探針2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA,索萊寶)、Trizol(TaKaRa)、PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒(TaKaRa)、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑(碧云天)、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(碧云天)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(碧云天)、銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)檢測(cè)試劑盒(碧云天)、過(guò)氧化氫酶(CAT)檢測(cè)試劑盒(碧云天)、還原型谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒(碧云天)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(碧云天)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒(碧云天)以及8肽膽囊收縮素(CCK-8)檢測(cè)試劑盒(碧云天)。

試驗(yàn)儀器：生物安全柜(Thermo1300Series)、倒置熒光顯微鏡(Nikon TS100)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo3111)、細(xì)胞破碎儀(Misonix S-400)、流式細(xì)胞儀(BD FACS-VerseTMFlow Cytometer 651154)、酶標(biāo)儀(Spec-traMax M2)以及分光光度計(jì)(Nanadrop2000,Thermo)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

MOGC系購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司，試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)H2O2濃度梯度(0、100、200、400和800 μmol/L)和4個(gè)培養(yǎng)時(shí)間(4、12、24和48 h)，共20個(gè)處理；測(cè)定細(xì)胞活力并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，以確定H2O2作用時(shí)間。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置5個(gè)H2O2濃度梯度(0、100、200、400和800 μmol/L)，共5個(gè)處理，H2O2處理24 h(通過(guò)測(cè)定細(xì)胞活力確定)后測(cè)定細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)ROS生成量、相關(guān)抗氧化酶活性和MDA含量以及凋亡相關(guān)基因表達(dá)，以確定H2O2最佳作用濃度，建立理想的MOGC氧化應(yīng)激模型。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

MOGC使用含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)棄去舊的培養(yǎng)基，加入PBS清洗后將廢液吸出，加入胰蛋白酶放入37 ℃培養(yǎng)箱消化5 min，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)變圓，并且很亮，加入培養(yǎng)基終止消化，用移液槍反復(fù)吹打，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，補(bǔ)充培養(yǎng)基。

1.3.2 細(xì)胞活力的測(cè)定

采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力。MOGC以1×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板中。其中，0 μmol/L H2O2處理為對(duì)照組，100、200、400和800 μmol/L H2O2處理為試驗(yàn)組，將只填加完全培養(yǎng)基設(shè)為空白對(duì)照，每個(gè)孔作為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%以上，吸出完全培養(yǎng)基，加入處理培養(yǎng)基。分別在4、8、12和24 h后吸去處理液，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃放置1 h，最后用酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度值。

細(xì)胞活力(%)=100[(A處理-A空白)/
(A對(duì)照-A空白)]。

1.3.3 細(xì)胞凋亡的測(cè)定

MOGC以1×105個(gè)/mL的密度接種于12孔板中，每個(gè)孔作為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%以上，吸出完全培養(yǎng)基，加入處理培養(yǎng)基。24 h后用胰蛋白酶于37 ℃消化4～5 min將細(xì)胞收集，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，1 000×g離心后得到細(xì)胞沉淀，加入PBS洗滌細(xì)胞，然后加入100 μL的1×Binding Buffer，加入5 μL異硫氰酸熒光素Annexin Ⅴ和5 μL PI室溫避光孵育20 min加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，利用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)ROS生成量的測(cè)定

MOGC以1×105個(gè)/mL的密度接種于12孔板中，每個(gè)孔作為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%以上，吸出完全培養(yǎng)基，加入處理培養(yǎng)基。24 h后用胰蛋白酶于37 ℃消化4～5 min將細(xì)胞收集，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，1 000×g離心后得到細(xì)胞沉淀，加入PBS洗滌細(xì)胞，然后配制好的DCFH-DA熒光探針重懸細(xì)胞，37 ℃孵育1 h然后1 000×g離心5 min，并用37 ℃預(yù)熱的PBS洗滌1～2次，用PBS重懸細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量。

1.3.5 抗氧化酶活性以及MDA含量的測(cè)定

MOGC以1×105個(gè)/mL的密度接種于12孔板中，每2孔作為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%以上，吸出完全培養(yǎng)基，加入處理培養(yǎng)基。24 h后，利用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞收集，收集的細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞破碎儀破碎，得到待測(cè)樣本。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定每個(gè)樣本的蛋白濃度。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書測(cè)得SOD、CuZn-SOD、CAT、GSH-Px活性和T-AOC以及GSH和MDA含量。

1.3.6 凋亡相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定

MOGC以1×105個(gè)/mL的密度接種于12孔板中，每2孔作為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%以上，吸出完全培養(yǎng)基，加入處理培養(yǎng)基。24 h后每孔加入1 mL Trizol試劑提取總RNA，每個(gè)樣品利用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度以及A260/A280值，每個(gè)樣品以600 ng的RNA為底物，利用PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄20 μL的cDNA，將cDNA和所測(cè)基因的上游引物和下游引物(表1)利用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。基因的相對(duì)表達(dá)量以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算。

表1 基因上游和下游引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件，采用ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，采用one-way Duncan氏法進(jìn)行多重比較，用FlowJo v10軟件進(jìn)行細(xì)胞凋亡和ROS生成量的分析，用GraphPad Prism 6 作圖，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度H2O2作用不同時(shí)間后對(duì)細(xì)胞活力的影響

如圖1-A所示，400和800 μmol/L H2O2處理24 h對(duì)細(xì)胞損傷較大，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，并且大部分細(xì)胞破碎物飄浮于培養(yǎng)基中；100和200 μmol/L處理24 h后，大部分細(xì)胞能維持正常的細(xì)胞形態(tài)并能貼壁生長(zhǎng)，但仍能看到少量細(xì)胞破碎物漂浮于培養(yǎng)液中。如圖1-B所示，通過(guò)H2O2作用不同的時(shí)間發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組細(xì)胞活力均顯著降低(P<0.05)。100和200 μmol/L H2O2處理MOGC小于12 h時(shí)，細(xì)胞活力較高；而當(dāng)H2O2濃度大于200 μmol/L并且作用時(shí)間超過(guò)12 h時(shí)，細(xì)胞活力低于50%；此外，當(dāng)H2O2濃度大于200 μmol/L時(shí)會(huì)引起細(xì)胞活力急劇下降。

2.2 不同濃度H2O2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，利用Annexin V/PI雙染色法，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定不同濃度H2O2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分為4個(gè)群：Q1為機(jī)械壞死細(xì)胞，Q2為晚期凋亡細(xì)胞，Q3為早期凋亡細(xì)胞，Q4為正常細(xì)胞。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著H2O2濃度的升高，正常細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(P<0.05)，而凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增多(P<0.05)，即細(xì)胞凋亡率顯著提高(P<0.05)。

A：流式細(xì)胞儀測(cè)定不同濃度的H2O2作用24 h后細(xì)胞凋亡結(jié)果，Q1為機(jī)械壞死細(xì)胞，Q2為晚期凋亡細(xì)胞，Q3為早期凋亡細(xì)胞，Q4為正常細(xì)胞，凋亡細(xì)胞=Q2+Q3。B：不同濃度H2O2處理24 h后MOGC凋亡率。

2.3 不同濃度H2O2對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS生成量的影響

如圖3所示，利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行ROS檢測(cè)，DCFH-A本身沒(méi)有熒光，但可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成二氯二氫熒光素(DCFH)，細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的二氯熒光素(DCF)，然后使用流式細(xì)胞儀測(cè)定不同濃度H2O2對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS生成量的影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，200、400和800 μmol/L H2O2處理MOGC 24 h后，細(xì)胞內(nèi)的ROS生成量顯著提高(P<0.05)；100 μmol/L H2O2組與對(duì)照組相比，雖然細(xì)胞內(nèi)ROS生成量有所提高，但差異不顯著(P>0.05)。

2.4 不同濃度H2O2對(duì)細(xì)胞中抗氧化酶活性以及MDA含量的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，400 μmol/L H2O2組細(xì)胞中SOD活性顯著降低(P<0.05)，200 μmol/L H2O2組細(xì)胞中SOD活性有降低的趨勢(shì)(P>0.05)，但各組細(xì)胞中Cu-ZnSOD活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，100、200 μmol/L H2O2組細(xì)胞中CAT活性有降低的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)；400、800 μmol/L H2O2組細(xì)胞中CAT活性顯著降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比，200 μmol/L H2O2組細(xì)胞中GSH含量有降低的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)；400、800 μmol/L H2O2組細(xì)胞中GSH含量顯著降低(P<0.05)；200、400和800 μmol/L H2O2組細(xì)胞中GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)。此外，各組細(xì)胞中T-AOC無(wú)顯著差異(P>0.05)，但200、400和800 μmol/L H2O2組細(xì)胞中過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量與對(duì)照組相比顯著提高(P<0.05)。

2.5 不同濃度H2O2對(duì)細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，800 μmol/L H2O2組細(xì)胞中Bim、Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)；200 μmol/L H2O2組細(xì)胞中Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量有提高的趨勢(shì)(P>0.05)，細(xì)胞中BcL-xLmRNA相對(duì)表達(dá)量有降低的趨勢(shì)(P>0.05)；而400、800 μmol/L H2O2組細(xì)胞中Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，細(xì)胞中BcL-xLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；100 μmol/L H2O2組細(xì)胞中與凋亡相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。此外，與對(duì)照組相比，200、400和800 μmol/L H2O2組細(xì)胞中SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而細(xì)胞中FoxO1、p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)；100 μmol/L H2O2組細(xì)胞中SRIT1、FoxO1和p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)，這表明SIRT1-FoxO1/p53可能是H2O2誘導(dǎo)MOGC凋亡過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)通路。

3 討 論

3.1 MOGC氧化應(yīng)激模型的建立

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)的活性分子如ROS自由基產(chǎn)生過(guò)多，氧化程度超出抗氧化物清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)動(dòng)態(tài)失衡的狀態(tài)，其會(huì)導(dǎo)致氧化損傷，表現(xiàn)為多種組織漸進(jìn)性損傷。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致雌性生殖系統(tǒng)中的卵巢顆粒細(xì)胞損傷甚至凋亡[19]，導(dǎo)致卵巢功能異常，但具體機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)使用H2O2處理MOGC，從而建立卵巢顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，并探究其可能的作用機(jī)制。

H2O2是ROS的一種重要形式，易于穿過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入到細(xì)胞中，產(chǎn)生高反應(yīng)活性的羥自由基，氧化細(xì)胞中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸[20-21]，造成過(guò)氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷。H2O2作為一種氧化劑，已被用于建立各種體外和體內(nèi)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型[22-23]。因此，本試驗(yàn)也通過(guò)H2O2誘導(dǎo)MOGC氧化損傷，建立氧化應(yīng)激模型。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同濃度H2O2處理MOGC后，細(xì)胞活力顯著降低，并且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，H2O2處理MOGC時(shí)間超過(guò)24 h后，會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，處理時(shí)間在12 h以內(nèi)，MOGC活力較高。建立MOGC氧化應(yīng)激模型的前提是使細(xì)胞具有一定的活力，細(xì)胞活力過(guò)低表明受到氧化損傷嚴(yán)重?zé)o法治療，細(xì)胞活力過(guò)高則表明沒(méi)有造成氧化損傷，不利于試驗(yàn)的進(jìn)行[24]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H2O2濃度為400和800 μmol/L時(shí)，會(huì)引起MOGC活力急劇下降；并且發(fā)現(xiàn)400、800 μmol/L H2O2處理24 h后，細(xì)胞核明顯縮小，染色質(zhì)凝集呈顆粒團(tuán)塊狀分布，大部分細(xì)胞破碎物漂浮于培養(yǎng)基中，說(shuō)明對(duì)細(xì)胞造成了不可逆的氧化損傷。此外，100、200 μmol/L H2O2對(duì)MOGC也有一定的影響，處理24 h后發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞能維持正常的細(xì)胞形態(tài)并能貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞活力保持在50%左右，并且有部分細(xì)胞破碎物漂浮于培養(yǎng)液中。和斌等[25]研究表明，使用250 μmol/L H2O2處理12 h，人卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞活力下降至對(duì)照組的60%左右。Zhang等[26]在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)豬卵巢顆粒細(xì)胞的研究中選用200 μmol/L H2O2處理12 h建立氧化應(yīng)激模型。本試驗(yàn)選擇H2O2處理MOGC 24 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，確定H2O2對(duì)MOGC的作用濃度，建立MOGC理想的氧化應(yīng)激模型。

3.2 不同濃度H2O2對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS生成量的影響

近年來(lái)越來(lái)越多的研究證明，在動(dòng)物繁殖過(guò)程中ROS起到了極其重要的作用[27-28]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2濃度的提高，MOGC中ROS的生成量逐漸提高，100 μmol/L H2O2組細(xì)胞內(nèi)ROS生成量與對(duì)照組相比差異不顯著，而200、400和800 μmol/L H2O2組細(xì)胞內(nèi)ROS生成量顯著高于對(duì)照組。Shen等[9]的研究也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果，表明細(xì)胞中ROS生成量的提高呈現(xiàn)出H2O2劑量依賴效應(yīng)。前人研究證明，ROS的積累導(dǎo)致卵巢功能損傷主要是由電子傳遞鏈中的復(fù)合物突變引起的[8]，H2O2作為一種強(qiáng)氧化劑會(huì)改變電子傳遞鏈中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脫氫酶活性，導(dǎo)致電子在傳遞過(guò)程中丟失，造成ROS生成過(guò)量[29]。當(dāng)卵巢內(nèi)ROS產(chǎn)生過(guò)量，機(jī)體自身因?yàn)闊o(wú)法清除掉多余的ROS，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白及DNA發(fā)生改變，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引發(fā)細(xì)胞程序性死亡。

3.3 不同濃度H2O2對(duì)細(xì)胞中抗氧化酶活性以及MDA含量的影響

機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)是自我防御系統(tǒng)之一，抗氧化酶活性可以表明機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。SOD是特異性清除超氧自由基的抗氧化酶類，CAT能清除細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化氫，GSH-Px是一種重要的過(guò)氧化物分解酶，能夠有效阻止自由基的生成和脂質(zhì)過(guò)氧化，由SOD、CAT和GSH-Px組成的酶促氧化系統(tǒng)可以及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，保護(hù)其免受氧化應(yīng)激損害，但嚴(yán)重的氧化應(yīng)激會(huì)使抗氧化酶活性下降[30-31]。此外，產(chǎn)生過(guò)量的ROS會(huì)引發(fā)細(xì)胞生物膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，能夠產(chǎn)生毒性作用；GSH則作為GSH-Px的底物，也是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[32]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，400 μmol/L H2O2組細(xì)胞中SOD活性顯著降低；200、400和800 μmol/L H2O2組細(xì)胞中GSH-Px活性顯著降低，并且細(xì)胞中MDA含量顯著提高；100 μmol/L H2O2組細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性和MDA含量與對(duì)照組相比差異不顯著；此外，400和800 μmol/L H2O2組細(xì)胞中CAT活性和GSH含量顯著降低，100和200 μmol/L H2O2組細(xì)胞中CAT活性和GSH含量與對(duì)照組相比差異不顯著。Deng等[33]研究發(fā)現(xiàn)，使用300 μmol/L H2O2處理雌性大鼠卵巢顆粒細(xì)胞后，H2O2組細(xì)胞中SOD、GSH-Px和CAT活性顯著降低，并且細(xì)胞中MDA含量顯著提高。本試驗(yàn)與前人研究結(jié)果相類似，表明H2O2能夠有效誘導(dǎo)MOGC產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致抗氧化酶活性降低，過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量提高。

3.4 不同濃度H2O2對(duì)細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，不同濃度H2O2處理MOGC后細(xì)胞凋亡率顯著提高；100、200和400 μmol/L H2O2處理24 h后，細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，而800 μmol/L H2O2組細(xì)胞凋亡率較高，顯著高于其他組，表明對(duì)細(xì)胞造成了嚴(yán)重的損傷。前人研究表明，H2O2處理細(xì)胞可發(fā)生凋亡現(xiàn)象，并且其凋亡程度隨著H2O2濃度升高而加強(qiáng)[34]，這與本研究結(jié)果相一致。細(xì)胞凋亡主要有2條途徑：一是內(nèi)在途徑直接通過(guò)線粒體釋放凋亡相關(guān)酶激活因子引起細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)級(jí)聯(lián)反應(yīng)造成細(xì)胞凋亡；二是外在途徑由胞外信號(hào)分子通過(guò)結(jié)合細(xì)胞膜表面的死亡受體激活細(xì)胞內(nèi)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)引發(fā)細(xì)胞凋亡[35]。H2O2引起的MOGC的細(xì)胞凋亡可能與某種途徑依賴的線粒體凋亡途徑相關(guān)。

雌性動(dòng)物卵巢中卵泡發(fā)生閉鎖時(shí)，有大量的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子參與了卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，例如雌激素受體α和β、FasL、Caspase家族蛋白以及B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族蛋白等[36]。已有研究證實(shí)，人和鼠的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的主要形式是線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，線粒體途徑的細(xì)胞凋亡是Bcl-2家族蛋白與Caspase家族蛋白共同作用的復(fù)雜過(guò)程[1，37-38]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，400和800 μmol/L H2O2組MOGC中Caspase-3的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高，Bcl-xL的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，并且800 μmol/L H2O2組MOGC中Bim、Caspase-9的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高；200 μmol/L H2O2組MOGC中Bim、Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比有所上升，Bcl-xL的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比有所下降，但差異不顯著；此外，100 μmol/L H2O2組MOGC中Bim、Bcl-xL、Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比均無(wú)差異差異。Caspase家族蛋白引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過(guò)程的中心環(huán)節(jié)，根據(jù)相關(guān)報(bào)道，在健康的卵泡中幾乎檢測(cè)不到Caspase家族相關(guān)基因的表達(dá)，而閉鎖卵泡中凋亡的顆粒細(xì)胞內(nèi)Caspase家族相關(guān)基因表達(dá)增加，并且表明Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)增加是反映卵巢顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖的標(biāo)志物[39-41]。Bcl-2家族包括2大類型，即Bim所在的促凋亡亞家族和Bcl-xL所在的抗凋亡亞家族。已有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Bcl-xL能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[42]；此外，在豬卵巢中發(fā)現(xiàn)閉鎖卵泡中的Bim的表達(dá)水平顯著高于健康卵泡[43]。表明Bcl-xL和Bim均在細(xì)胞凋亡中起到了關(guān)鍵作用。SIRT1可以通過(guò)對(duì)其底物分子的去乙?；饔茫瑓⑴c多種細(xì)胞生理過(guò)程，有大量研究表明SIRT1參與調(diào)控細(xì)胞的氧化應(yīng)激從而影響細(xì)胞的存活[44-45]。近年來(lái)的報(bào)道顯示，F(xiàn)oxO1和p53信號(hào)通路是調(diào)控哺乳動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的主要通路之一，并且二者均是SIRT1在細(xì)胞內(nèi)的作用底物[9,46-47]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，200、400和800 μmol/L H2O2組MOGC中SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，F(xiàn)oxO1、p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高；而100 μmol/L H2O2組MOGC中SRIT1、FoxO1和p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。FoxO1和p53表達(dá)增加，可以通過(guò)Caspase蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)引發(fā)線粒體途徑的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[38,48]，而SIRT1可以通過(guò)去乙?；饔谜{(diào)節(jié)FoxO1和p53信號(hào)通路，抑制FoxO1和p53的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率[49]。有研究表明，SIRT1激活劑可通過(guò)SIRT1-FoxO1通路緩解氧化應(yīng)激造成的肝臟損傷[50]，也能抑制破骨細(xì)胞的形成、增加破骨細(xì)胞的凋亡[51]。由此說(shuō)明，SIRT1及其下游信號(hào)通路參與了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但對(duì)顆粒細(xì)胞中SIRT1及其下游FoxO1和p53通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的報(bào)道較少。通過(guò)本試驗(yàn)研究結(jié)果得知，氧化應(yīng)激可能通過(guò)SIRT1-FoxO1/p53信號(hào)通路誘導(dǎo)MOGC凋亡。

4 結(jié) 論

① 與0 μmol/L H2O2處理相比，200 μmol/L H2O2處理MOGC 24 h后細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞內(nèi)ROS生成量顯著提高，相關(guān)抗氧化酶活性降低，氧化產(chǎn)物MDA含量顯著增加，凋亡相關(guān)基因表達(dá)增加，因此確定了200 μmol/L H2O2處理24 h為MOGC氧化應(yīng)激模型成功建立的方法。

② 與對(duì)照組相比，200、400和800 μmol/L H2O2組細(xì)胞中SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞中FoxO1、p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高，說(shuō)明SIRT1-FoxO1/p53是參與H2O2誘導(dǎo)MOGC氧化應(yīng)激的關(guān)鍵信號(hào)通路，為進(jìn)一步探究SIRT1調(diào)控MOGC氧化應(yīng)激損傷的具體機(jī)制提供了思路。