槲皮素治療高尿酸血癥的機制研究

陳海青 周 璇 王秀秀

高尿酸血癥是由于人體內(nèi)尿酸的合成增加或排出減少等原因引起的一種代謝性疾病，最主要的危害是引起痛風(fēng)。越來越多的研究表明高尿酸血癥與痛風(fēng)、高血壓、慢性腎臟病、肥胖、糖尿病、腦卒中等代謝性疾病密切相關(guān)。隨著人們生活習(xí)慣的改變，我國高尿酸血癥逐年上升，特別是在沿海地區(qū)，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。目前降尿酸的藥物主要有黃嘌呤氧化酶抑制劑、尿酸轉(zhuǎn)運體抑制劑和重組尿酸酶補充劑等，例如秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素和別嘌醇等，但對肝腎毒性較大。隨著中藥的發(fā)展，利用中藥治療高尿酸血癥的研究越來越來多，中藥越來越成為療效確切、安全性高的降尿酸藥物[1,2]。

槲皮素是一類黃酮類化合物，廣泛存在于各種植物性食物中，具有抗氧化、抗炎等生物活性。已有大量研究表明槲皮素具有降尿酸、治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用[3]。但對于槲皮素降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的機制探究少有報道。本研究旨在通過采用尿酸酶敲除建立穩(wěn)定的小鼠高尿酸血癥模型，研究槲皮素降低血清尿酸水平的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物尿酸酶基因敲除小鼠，雄性，體質(zhì)量(24±2)g;購自南方動物模式中心。以正常野生型大小一致的雄性小鼠為對照。分籠飼養(yǎng)，保持室溫25 ℃，通風(fēng)良好，自然光照，正常飲食飲水。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 藥品與試劑槲皮素(上海將來實業(yè)有限公司，純度98%，批號:A007353-50 g)。Trizol(Thermo Scientific 公司)；PMSF(Sigma-Aldrich 公司)；蛋白裂解液(碧云天)；BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific 公司)；GLUT9、ABCG2、URAT1抗體購置abcam公司。引物均有生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及取材將SPF級雄性小鼠分為野生型對照組(wt)、高尿酸模型組(HUA)，及槲皮素低、中、高劑量組(100、200、400 mg /kg)組，每組8只。鑒定出高尿酸血癥小鼠純合子第5周起，給小鼠灌胃對應(yīng)質(zhì)量濃度槲皮素溶液，每日1 次，連續(xù)2周。灌胃2周后，內(nèi)眥取血。頸椎脫位處死小鼠;取腎臟及回腸、空腸放于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 血清生化指標(biāo)檢測取血于3500 r·min-1離心10 min，分離血清，全自動生化分析儀測定尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、總膽固醇(TC)、血糖(Glu)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的濃度。取出肝臟組織加組織裂解液制備成肝組織勻漿液，高速離心，取上清液用BCA法測定蛋白濃度。

1.2.3 RT-qPCR檢測腎臟、回腸、空腸中尿酸轉(zhuǎn)運體GLUT9、ABCG2、URAT1的表達。利用Trizol提取腎臟、回腸和空腸中總RNA放于紫外分光度計上檢測 RNA 的濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明建立 20 μl 反應(yīng)體系：6 μl DEPC 水，0.5 μl RNA 酶抑制劑，2 μl 隨機引物，2 μl總RNA，將20 μl反應(yīng)溶液放于37 ℃水浴鍋中保溫60 min合成cDNA。利用 SYBR Green 染料，采用兩步法設(shè)置程序：95 ℃、5 min，預(yù)變性；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40 個循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，置于ABl7500 PCR儀進行實時熒光定量PCR，檢測腎臟、回腸、空腸中尿酸轉(zhuǎn)運體mRNA的表達情況。利用 Primer Priemer 5.0 軟件設(shè)計引物。引物如下：URAT1:F 5’-ATGGCTGGGTTTACGACCAC-’3,R 5’- GCCCAAACCTATCTGAGGCA-’3；GLUT9：F 5’-CTTCCTGTGGACTCTGCCTC-’3,R5’-GACGAGCGAGAAGGACCATT-’3；ABCG2：F 5’-TCTCAACTCCACTGCAAGC-’3,R 5’-ACGTGGTCATTACTGGAAGACA-’3；OAT1：F 5’-GCAGCCTATGCACCCAACTA-’3，R5’-AACTGGCCCAAGCTGTAGAC-’3；OAT2：F 5’-ACCCTGGTTGGGTACCTGAT-’3，R5’-AGAAGCCATCGTGCAGACTC-’3；OAT2：F 5’-TAAAACAACCCTTTGGCGGC-’3，R5’- GAGCTGGATTCAGTTGGGCT-’3。結(jié)果分析：采用ΔΔCt法分析每個基因的Ct值，以內(nèi)參 GAPDH為對照值，進行標(biāo)準(zhǔn)化計算后得出結(jié)果，與對照組比較，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.4 蛋白印記檢測腎臟、腸道中尿酸轉(zhuǎn)運體ABCG2表達將組織切成小塊，按每 100 mg 組織加入 1 ml含1% PMSF的RIPA裂解液冰上研磨勻漿，14000 rpm離心15 min，取上清，BCA 法測定蛋白含量。按1∶4比例加上蛋白上樣緩沖液，金屬浴加熱煮沸 10 min后進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，將膠上蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF 膜。將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF 膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h,孵育兔抗ABCG2、GLUT9和UART1一抗2 h，在辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗反應(yīng)液37 ℃孵育1 h，ECL 顯色后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，通過 Image.Pro Plus 軟件分析與內(nèi)參條帶的灰度值比值，比較各組差異。

1.2.5 ELISA試劑盒測定肝臟中黃嘌呤氧化酶活性取肝臟組織，按每100 mg組織加入1 ml含1% PMSF的RIPA裂解液，冰上研磨勻漿，14000 rpm離心15 min，取上清，加到96孔板中，在相同緩沖液中加入18 μl 15 μm黃嘌呤引發(fā)反應(yīng)，在加入底物緩沖液后，立即測量37 ℃反應(yīng)30 min在295 nm的吸光度?；谀蛩針?biāo)準(zhǔn)曲線，從吸光度增加30 min計算尿酸產(chǎn)量。用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定肝勻漿中的蛋白質(zhì)濃度。XO活性表示為每分鐘每毫克蛋白質(zhì)產(chǎn)生的尿酸含量。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對高尿酸血癥小鼠血清生化指標(biāo)影響與正常組相比，高尿酸血癥組血清UA、Cr、BUN顯著升高(P<0.05)，這表明高尿酸血癥模型造模成功。此外，高尿酸血癥小鼠LDL含量也升高，但甘油三酯和葡萄糖含量沒有明顯變化。與高尿酸血癥小鼠相比，400 mg/kg體質(zhì)量的槲皮素注射顯著抑制血清UA濃度，血清肌酐與尿素氮水平也降低，并且呈劑量依賴性。但不同濃度的槲皮素對甘油三酯和葡萄糖水平影響不明顯。見圖1。

注：矩形條及其誤差條分別代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與高尿酸血癥組相比，#P<0.05，## P<0.01圖1 槲皮素對高尿酸血癥小鼠血清生化指標(biāo)影響

2.2 槲皮素對高尿酸血癥小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響我們進一步檢測了腎臟黃嘌呤氧化酶活性變化，黃嘌呤氧化酶在UA合成中起重要作用。與正常對照相比，高尿酸血癥肝臟黃嘌呤氧化酶活性顯著升高(P<0.05)。與高尿酸血癥模型組相比，高濃度槲皮素顯著降低了黃嘌呤氧化酶的活性，但低濃度和中濃度的槲皮素對黃嘌呤氧化酶活性無顯著影響。見圖2。

2.3 槲皮素對小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運體mRNA的影響與對照組比較，模型組小鼠腎臟GLUT9和 URAT1 mRNA顯著升高(P<0.01)，而轉(zhuǎn)運體ABCG2 mRNA顯著降低，OAT1、OAT2和OAT3無顯著變化。與模型組比較，槲皮素高、中劑量可恢復(fù)高尿酸血癥小鼠腎臟降低的ABCG2 mRNA(P<0.01)，降低GLUT9mRNA 表達，對URAT1、OAT1、OAT2和OAT3mRNA的表達無明顯影響。見圖3。

注：矩形條及其誤差條分別代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與高尿酸血癥組相比，#P<0.05，##P<0.01圖2 槲皮素對高尿酸血癥小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響

注：矩形條及其誤差條分別代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與高尿酸血癥組相比，#P<0.05，##P <0.01圖3 槲皮素對高尿酸血癥小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運體mRNA表達的影響

2.4 槲皮素對小鼠小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運蛋白GLUT9、URAT1和ABCG2表達水平的影響通過蛋白印記，我們進一步檢測了槲皮素對小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運蛋白GLUT9、URAT1和ABCG2表達水平的影響。結(jié)果顯示，與模型組對比，高濃度的槲皮素顯著降低了GLUT9和URAT1的表達，低、中濃度對GLUT9和URAT1的表達無顯著影響。中、高濃度的槲皮素顯著增加了ABCG2的表達。見圖4。

注：矩形條及其誤差條分別代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與高尿酸血癥組相比，#P<0.05，## P<0.01圖4 槲皮素對小鼠小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運蛋白GLUT9、URAT1和ABCG2表達水平的影響

2.5 槲皮素對小鼠腸道轉(zhuǎn)運體GLUT9、URAT1和ABCG2 mRNA表達的影響與對照組相比，高尿酸模型組腸道轉(zhuǎn)運體ABCG2表達明顯下降，GLUT9升高，URAT1無明顯變化。而與高尿酸血癥模型組相比，槲皮素高劑量組顯著提高了ABCG2 表達水平，降低了GLUT9的表達，而對URAT1無明顯影響。見圖5。

注：矩形條及其誤差條分別代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與高尿酸血癥組相比，#P<0.05，##P<0.01圖5 槲皮素對小鼠腸道轉(zhuǎn)運體GLUT9、URAT1和ABCG2 mRNA表達的影響

3 討論

高尿酸血癥是人類最常見的代謝紊亂病之一，最常見的是導(dǎo)致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和尿酸腎結(jié)石。高尿酸血癥也與高血壓和高脂血癥、糖尿病和肥胖的發(fā)展有關(guān)。尿酸水平是預(yù)防痛風(fēng)和其他疾病的關(guān)鍵因素。在過去的幾年中，大量學(xué)者對黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇降尿酸作用越來越感興趣。然而別嘌呤醇具有誘發(fā)過敏綜合征，Stevens-Johnson綜合征、腎毒性等不良作用。一些植物化學(xué)物質(zhì)如黃酮類化合物因其具有天然的黃嘌呤氧化酶抑制特性，并對高尿酸血癥一些并發(fā)癥具有的保護作用而受到重視[4]。槲皮素是水果和蔬菜中的主要黃酮醇，在蘋果、葡萄、漿果、紅洋蔥、西蘭花等植物中含量豐富。作為有效的抗氧化劑，槲皮素的生物活性包括抗癌劑、抗炎性和預(yù)防視網(wǎng)膜變性等已被大量研究。盡管大量研究表明槲皮素通過抑制黃嘌呤氧化酶活性降低血尿酸作用[5]，但機制仍不清楚，特別是槲皮素對尿酸轉(zhuǎn)運體的研究少有報道。本實驗通過基因敲除建立高尿酸模型小鼠，發(fā)現(xiàn)槲皮素能降低血尿酸水平，其機制可能通過調(diào)節(jié)腎臟、腸道中尿酸轉(zhuǎn)運體ABCG2和GLUT9來降尿酸的。

尿酸酶(Uox)是尿酸分解的關(guān)鍵酶，尿酸酶敲除會導(dǎo)致尿酸分解異常，進而導(dǎo)致高尿酸。我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)，獲得Uox基因敲除的雜合子小鼠，通過雜合子交配，獲得Uox基因敲除純合子小鼠。我們的結(jié)果表明這種基因敲除的小鼠尿酸明顯高于正常組。相對于其他建模方法如抑制尿酸轉(zhuǎn)運體功能、增加尿酸前體物質(zhì)攝入、抑制尿酸酶功能等，基因敲除建模更加穩(wěn)定，也更有利于研究藥物對尿酸排泄的作用機制。給小鼠定期注射槲皮素2周后，能顯著降低血清尿酸水平，并且與槲皮素呈劑量依賴型。此外，高劑量槲皮素也能顯著降低尿酸氮、肌酐的含量，對腎臟起到保護作用。之前很多研究也表明槲皮素能降尿酸，和我們的研究一致[6]。

高尿酸血癥90%以上是因尿酸排泄減少所致，腎臟為尿酸排泄的主要器官，由位于腎小管上皮細胞的尿酸轉(zhuǎn)運蛋白共同協(xié)調(diào)完成。按照功能不同可分為重吸收相關(guān)蛋白、排泄相關(guān)蛋白和骨架蛋白。這些尿酸轉(zhuǎn)運蛋白是高尿酸血癥和其他代謝紊亂的紐帶，也是新型降尿酸藥物的研究靶點[7]。其中重吸收和排泄相關(guān)蛋白一直是研究的熱點，在治療高尿酸血癥中起著重要的作用。腎臟中的尿酸處理非常復(fù)雜，涉及腎小球濾過，腎小管重吸收和分泌。位于近端腎小管細胞頂端和基底外側(cè)膜的尿酸轉(zhuǎn)運蛋白URATI和GLUT9分別參與腎臟對尿酸的重吸收。大量研究表明URAT1、GLUT9L基因敲除小鼠的尿酸排泄顯著增加[8～12]。我們研究中發(fā)現(xiàn)，高劑量槲皮素能顯著降低GLUT9的表達，而對URAT1轉(zhuǎn)錄沒有明顯影響。有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白包括OAT1、OAT2和OAT3雖然也對尿酸鹽的攝取有關(guān)[13～15]，但在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高尿酸血癥小鼠組及槲皮素處理組對OAT1、OAT2和OAT3沒有明顯影響。而在腎臟中尿酸排泄相關(guān)蛋白ATP 結(jié)合盒蛋白家族G 蛋白亞家族成員2(ABCG2)明顯受槲皮素的影響，并且呈劑量依賴性，這在蛋白和mRNA水平上都得到驗證。ABCG2在腎臟和腸道中均大量表達，位于上皮細胞的管腔側(cè)膜，與尿酸排泄具有重要的關(guān)系[16]。ABCG2表達降低不僅會影響腎臟排泄尿酸的能力，還會降低腸道尿酸排泄，繼而加重腎臟的尿酸負荷，導(dǎo)致腎臟損傷。以ABCG2為藥物靶點的藥物越來越受到重視，提高ABCG2在腸道的表達，可減輕腎臟排尿酸負荷，避免腎小管功能受損。小腸是許多類黃酮糖苷的主要吸收位點，可以在腸的不同部位被吸收。我們的研究表明槲皮素不僅可以影響腎臟中的轉(zhuǎn)運體的表達，還可以降低腸道中GLUT9表達，增加ABCG2的表達，增加尿酸的排泄，起到雙向降尿酸的作用。

總之，槲皮素可明顯降低高尿酸血癥大鼠血清尿酸水平，其降尿酸機制是通過降低腎臟和腸道尿酸轉(zhuǎn)運體GLUT9，增加ABCG2表達實現(xiàn)。

(本文校對：周金榮 收稿日期2019-01-25)