不同產(chǎn)地火絨草HPLC 指紋圖譜的建立及化學(xué)模式識別

趙 玥， 齊 越， 單國順， 王光函， 王 冰?

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)， 遼寧 大連 116600； 2. 遼寧省中醫(yī)藥研究院， 遼寧 沈陽 110034）

火絨草目前還未被《中國藥典》 收載， 長久以來沒有法定的標(biāo)準(zhǔn)來衡量， 該野生資源豐富， 不同生長地區(qū)的環(huán)境有很大的差距， 光照、 年積溫、降水量、 土壤質(zhì)地等生態(tài)因子都可能造成其外部形態(tài)和內(nèi)在質(zhì)量發(fā)生變化[5-6］。 由于中藥成分復(fù)雜，個別成分的測定不能完全代表其質(zhì)量的復(fù)雜體系，因此選用多指標(biāo)質(zhì)量控制模式來全面反映所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量， 從而體現(xiàn)整體性和綜合作用。本研究采用HPLC 法對遼寧、 河北等26 個產(chǎn)地35批火絨草進(jìn)行指紋圖譜研究， 通過與對照品比對、相似度評價(jià)、 主成分分析、 聚類分析等識別技術(shù)進(jìn)行分析， 以期為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； 電子天平（萬分之一，上海上天精密儀器有限公司）； HH 系列恒溫水浴鍋（江蘇金壇儀器廠）。 數(shù)據(jù)分析采用軟件中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004、 SPSS Statistics 20.0 軟件。

1.2 試藥 咖啡酸 （Y17D6C7672）、 綠原酸（R055F6F1）、 阿魏酸（H25M6L1）、原兒茶酸（Z30M6L1）、原兒茶醛 （Y01013FB14） 對照品，含有量均＞98%， 均購于上海源葉生物科技有限公司。 乙腈、 磷酸為色譜純； 其他試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

26 個產(chǎn)地火絨草共35 批， 其中3 批購于安國藥房， 其余采自各地， 由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定為正品， 見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相0.1% 磷酸（A） -乙腈（B）， 梯度洗脫（0 ～10 min， 10% ～12% B； 10 ～20 min， 12% ～14% B； 20 ～30 min， 14% ～16% B；30 ～40 min， 16% ～22% B； 40 ～50 min， 22% ～30% B； 50～80 min， 30% ～52% B）； 柱溫25 ℃；體積流量1 mL／min； 檢測波長290 nm。

2.2 供試品溶液配制 取各產(chǎn)地火絨草剪切成段，各精密稱定1 g 置錐形瓶中， 加入50%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量， 回流提取1 h， 放冷， 50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 過濾， 取續(xù)濾液， 0.45 μm 微孔濾膜過濾， 取續(xù)濾液， 即得。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸、 咖啡酸、阿魏酸、 原兒茶醛、 原兒茶酸適量， 加甲醇溶解制成 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為1.30、 1.66、 1.18、 1.04、1.34 mg／mL 的貯備液， 分別吸取0.5 mL 定容至10 mL 量瓶中， 即得。

2.4 方法學(xué)考察

101A-1型數(shù)顯電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；JA503型電子天平，常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司產(chǎn)品；JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；DZ-260T型DZQ系列真空包裝機(jī)。

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一火絨草 （S1）， 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次， 選取綠原酸作為參照峰，測得特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD 均小于3%， 表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一火絨草（S1） 5 份，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣， 測得各特征峰的相對保留時間、 相對峰面積RSD 均小于3%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（S1） 溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下于0、 2、 6、 8、 12、 24 h進(jìn)樣， 測得各特征峰的相對保留時間、 相對峰面積RSD 均小于3%， 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜建立 35 批不同產(chǎn)地、 采收期火絨草按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣， 并將所測的數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度計(jì)算軟件（2012 版）， S1 號樣品色譜圖中色譜峰峰形、 分離度良好， 基線平整， 故選擇其作為參照譜圖， 經(jīng)多點(diǎn)校正后自動匹配生成的對照指紋圖譜， 見圖1～3， 共獲得19 個共有峰，通過比較樣品和對照品色譜分析保留時間及紫外吸收譜圖區(qū)， 確定綠原酸、 原兒茶醛2 種共有成分；5 個對照品沒有完全被指認(rèn)為共有峰， 可能是不同產(chǎn)地藥材中成分差異造成的。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

圖1 樣品HPLC 指紋圖譜共有模式Fig.1 Common pattern of HPLC fingerprints of samples

2.6 指紋圖譜分析

2.6.1 相似度評價(jià) 不同產(chǎn)地火絨草相似度見表2。 結(jié)果表明， 35 批樣品與對照圖譜的相似度較高， S19 鞍山、 S26 青?，斍呖h、 S28 河北空中草

圖2 對照品HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of reference substances

圖3 35 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of thirty-five batches of samples

表2 35 批樣品相似度Tab.2 Similarities of thirty-five batches of samples

原景區(qū)的相似度相對較低， 分別為0.898、 0.893、0.819， 其余均大于0.9； S1 ～S11 均為鐵嶺市采集， 相似度RSD 在2.27%以下， 表明采于當(dāng)?shù)卣哔|(zhì)量均一性較好； S12 ～S15 為5 月至8 月沈陽產(chǎn)地， 相似度RSD 在1.21%以下， S22～S25 為5 月至8 月葫蘆島產(chǎn)地， 相似度RSD 在2.45% 以下，表明不同產(chǎn)地、 采收期樣品雖基本類似， 但在質(zhì)量上存在一定差異， 沈陽產(chǎn)地質(zhì)量均一性好于葫蘆島產(chǎn)地。

2.6.2 化學(xué)成分分析 不同產(chǎn)地樣品共19 個共有峰， 不同樣品同一共有峰的峰面積RSD 較大， 均大于50%， 表明所含成分種類相似， 但含有量差異明顯。 以不同產(chǎn)地樣品已指認(rèn)有效成分（峰2為原兒茶醛， 峰3 為綠原酸） 峰面積之和作圖，比較其含有量變化， 結(jié)果見圖4， 可知S23 葫蘆島產(chǎn)地最低， S31 河南三門峽產(chǎn)地最高； 不同采收期樣品中， 沈陽祝家產(chǎn)地7 月、 葫蘆島產(chǎn)地5 月最高， 表明不同產(chǎn)地、 采收期樣品化學(xué)成分變化顯著， 藥材質(zhì)量有很大差異。

圖4 不同產(chǎn)地樣品2 種有效成分峰面積總和Fig.4 Peak area sums of two kinds of effective components in samples from different growing areas

2.6.3 聚類分析 利用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析， 將19 個共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行聚類分析， 結(jié)果見圖5， 可知除去沈陽祝家鎮(zhèn)及葫蘆島產(chǎn)地的5 月至7 月樣品， 剩余29 批整體可分為2大類， S4、 S26、 S27、 S31、 S32 被歸為一類， 其他產(chǎn)地被歸為一類， 即青海省、 河南省、 遼寧昌圖縣泉頭鎮(zhèn)歸為一類， 遼寧省其他產(chǎn)地、 河北省歸為一類。 由此表明， 產(chǎn)地相同或地理位置相近的樣品被聚在一起， 與相似度結(jié)果基本一致。

圖5 29 批樣品樹狀圖Fig.5 Dendrogram of twenty-nine batches of samples

2.6.4 主成分分析 為進(jìn)一步探討不同產(chǎn)地樣品之間的差異， 在相似度和聚類分析的基礎(chǔ)上， 對指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析， 以標(biāo)準(zhǔn)化后的共有峰峰面積為變量， 利用SPSS20.0 軟件進(jìn)行處理。 結(jié)果見表3。

以特征值大于1 為提取標(biāo)準(zhǔn)， 得前4 個成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為88.853%， 代表了火絨草19 個共有變量88.853%的信息量， 具有較好的代表性， 由載荷矩陣獲得的載荷圖見圖6。 由圖可知， 距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的幾個點(diǎn)為主成分中權(quán)重值最大的成分， 表明其在區(qū)分指紋圖譜差異中起決定性作用。

表3 相關(guān)矩陣Tab.3 Correlation matrices

圖6 各成分載荷圖Fig.6 Loading diagram of various constituents

以各主成分相應(yīng)貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)， 對各產(chǎn)地樣品進(jìn)行綜合評價(jià)， 得綜合得分及排序情況， 見表4。 由表可知， 鐵嶺昌圖泉頭鎮(zhèn)（S4） 產(chǎn)地綜合評分最高， 表明其成分含有量較其他批次高， 與聚類分析所得結(jié)果吻合， 即2 種手段可互為佐證。

3 討論

3.1 條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)對檢測波長、 流動相、 提取方式、 溶劑、 時間進(jìn)行考察， 通過HPLC-DAD檢測器全波長掃描， 綜合考慮共有峰的高度、 數(shù)量、 對照品最大吸收波長， 最終確定檢測波長為290 nm。 考察甲醇、 乙醇2 種溶劑及提取時間30 min、 1 h、 2 h， 優(yōu)化出最佳工藝為火絨草用50%乙醇回流提取1 h。 考察甲醇-水、 乙腈-水、乙腈-磷酸等流動相系統(tǒng)， 最終選擇乙腈-磷酸， 此條件下各色譜峰保留時間適中， 數(shù)量較多， 分離度較好， 基線穩(wěn)定， 能體現(xiàn)更多火絨所含成分， 有利于指紋圖譜的建立與分析。

3.2 結(jié)果分析 已有文獻(xiàn)報(bào)道采用化學(xué)識別模式對中藥材進(jìn)行指紋圖譜研究[7-13］， 能充分體現(xiàn)藥材整體特征。 聚類分析根據(jù)藥材化學(xué)成分， 能將其所屬類別準(zhǔn)確劃分； 主成分分析可篩選出共有特征成分， 找出決定性因素， 并得到綜合得分和排名， 兩者相互結(jié)合相互補(bǔ)充， 更加有利于客觀地評價(jià)中藥材真?zhèn)渭捌滟|(zhì)量優(yōu)劣。

表4 各樣品綜合得分及排序Tab.4 Comprehensive scores and ranks of various samples

本實(shí)驗(yàn)采用指紋圖譜相似度分析、 聚類分析、主成分分析對不同產(chǎn)地、 采收期火絨草共有峰進(jìn)行對比研究， 結(jié)果表明大部分產(chǎn)地樣品相似度較高；不同產(chǎn)地、 相同采收期質(zhì)量不均一， 有一定差異性； 不同產(chǎn)地藥材明顯分為2 類， 遼寧鐵嶺昌圖泉頭鎮(zhèn)、 青海省、 河南省歸為一類， 遼寧其他地區(qū)、河北省歸為一類。 各產(chǎn)地氣候、 地理位置等生態(tài)環(huán)境的不同直接影響到藥材次生代謝產(chǎn)物（化學(xué)成分） 積累， 從而造成不同產(chǎn)地樣品質(zhì)量參差不齊，因此生態(tài)環(huán)境相似或地理位置相近的產(chǎn)地被歸為一類。 綜上所述， 本實(shí)驗(yàn)建立火絨草HPLC 指紋圖譜， 可為該藥材品質(zhì)評價(jià)和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。