高寒草甸牧草內(nèi)生解淀粉芽胞桿菌261MY6發(fā)酵工藝優(yōu)化

李統(tǒng)華, 馮中紅, 楊成德

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

東祁連山位于甘肅、青海交界處，青藏高原邊緣[1]。由于人類長(zhǎng)期干擾和空氣稀薄、太陽(yáng)輻射強(qiáng)烈等惡劣的自然條件使其形成了脆弱的高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)，高寒草甸牧草及內(nèi)生菌是其重要組成部分，維持著生態(tài)系統(tǒng)的平衡。牧草內(nèi)生細(xì)菌可溶磷、固氮和分泌IAA[2-3]，從而促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育，提高宿主植物的產(chǎn)量及抵抗逆境(抗寒、耐熱和抗病蟲害)的能力[4]。解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)常用的根際促生菌和益生菌，對(duì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育和生物防治有著顯著的作用[5-6]，生物學(xué)功能多樣且效力顯著的內(nèi)生解淀粉芽胞桿菌對(duì)生物防治的研究意義重大。目前，國(guó)內(nèi)外已有大量的學(xué)者對(duì)解淀粉芽胞桿菌進(jìn)行研究，Hyo-Song等[7]報(bào)道了解淀粉芽胞桿菌KB3通過產(chǎn)生脂肽等物質(zhì)對(duì)病原真菌起到了抑制作用；Torres等[8]報(bào)道了解淀粉芽胞桿菌PGPBacCA1對(duì)菌核病菌(Sclerotiumrolfsii)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)和青霉屬(Penicilliumspp.)有抑制作用；劉泉成等[9]報(bào)道了解淀粉芽胞桿菌對(duì)玉米4種病害病原菌有廣譜的抑制作用；張榮勝等[10]報(bào)道了解淀粉芽胞桿菌Lx-11發(fā)酵上清液對(duì)水稻植株的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。前期研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌261MY6對(duì)馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、馬鈴薯褐腐病菌(Stysanusstemonitis)、孜然根腐病菌(F.Solani)、黃瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、馬鈴薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)和番瓜根腐病菌(Fusariumsp.)的抑制率均在50%以上，其中對(duì)馬鈴薯褐腐病菌抑制率高達(dá)96.10%。因此，本研究測(cè)定高寒草甸牧草內(nèi)生解淀粉芽胞桿菌261MY6的生物學(xué)特性，并結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為解淀粉芽胞桿菌261MY6規(guī)?；a(chǎn)，開發(fā)生物農(nóng)藥新型菌劑和下一步作為生物農(nóng)藥開發(fā)登記奠定基礎(chǔ)，并為進(jìn)田間試驗(yàn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基；NB培養(yǎng)液，配方詳見參考文獻(xiàn)[11]。

供試碳源：蔗糖、玉米淀粉、水溶性淀粉、麥芽糖、乳糖。

供試氮源：尿素、(NH4)2SO4、KNO3、NH4Cl、酵母膏。

無(wú)機(jī)鹽離子：MgSO4、KH2PO4、MnSO4、CuSO4、CaCl2均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 菌株生物學(xué)特性的研究[12]

1.2.1生長(zhǎng)溫度測(cè)定 1) 最低最高溫度測(cè)定分別設(shè)低溫梯度0，2，4，6，8，10，12，14，16℃和高溫梯度45，47，49，51，53，55，57，59，61℃，將菌株261MY6接種于NA斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線并置于不同溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察其生長(zhǎng)情況。

2) 致死溫度測(cè)定將0.1 mL待測(cè)菌株培養(yǎng)液接于裝10 mL NB培養(yǎng)液的試管中，分別經(jīng)90，91，92，93，94，95，100，105和110℃的高溫處理10 min后，取100 μL菌懸液均勻涂布于NA平板上，并于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察記錄菌落生長(zhǎng)情況。

3) 最適溫度測(cè)定取0.1 mL待測(cè)菌株培養(yǎng)液接于裝10mL NB培養(yǎng)液的試管中，以接無(wú)菌水培養(yǎng)液為對(duì)照，分別置于22，24，26，28，32，34和36℃的180 rpm搖床培養(yǎng)，24 h后測(cè)定OD600。

1.2.2最適pH測(cè)定 取0.1 mL待測(cè)菌株培養(yǎng)液接于裝10mL NB培養(yǎng)液的試管，設(shè)pH值3，4，5，6，7，8，9，10和11，以無(wú)菌水培養(yǎng)液為對(duì)照，于28℃、180 rpm搖床中培養(yǎng)，12 h后測(cè)定OD600，檢測(cè)最適pH。

1.2.3生長(zhǎng)曲線測(cè)定 取0.1mL待測(cè)菌株培養(yǎng)液接于裝10 mL NB培養(yǎng)液的試管中，以接無(wú)菌水的培養(yǎng)液為對(duì)照，分別設(shè)溫度22，24，26，28，32，34和36℃，于轉(zhuǎn)速為180 rpm的搖床(pH生長(zhǎng)曲線測(cè)定時(shí)溫度為28℃)中進(jìn)行培養(yǎng)，并測(cè)定記錄OD600。檢測(cè)生長(zhǎng)曲線時(shí)前3 h每隔30 min測(cè)一次，3 h后每隔1 h測(cè)一次，后制作生長(zhǎng)曲線；24 h后檢測(cè)最適溫度。

以上處理與對(duì)照均3次重復(fù)。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

種子液制備：將已活化的新鮮待測(cè)生防菌接至NB培養(yǎng)液(100 mL/150 mL三角瓶)中，振蕩培養(yǎng)(180 rpm，28℃)24 h，制得種子液。

最佳碳、氮源及無(wú)機(jī)鹽離子的篩選：分別用不同供試碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽等量替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液(40 mL/150 mL三角瓶)中的葡萄糖、蛋白胨和氯化鈉，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液為對(duì)照，滅菌后接入2 mL種子液，振蕩培養(yǎng)(180 rpm，28℃) 24 h，以測(cè)定不同發(fā)酵液吸光度值(OD600)來(lái)確定最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽離子。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選結(jié)果，將得出的最佳碳、氮源和無(wú)機(jī)鹽離子按不同濃度進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，其他步驟同上，分析試驗(yàn)結(jié)果，明確最優(yōu)培養(yǎng)基組合(表1)。

表1 L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The design of L9(33) orthogonal experiment

搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化：在最優(yōu)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)定不同的發(fā)酵參數(shù)，pH值：6，6.5，7，7.5和8，溫度：20，24，28，32和36℃，搖床轉(zhuǎn)速：120，150，180，210，240和270 rpm，接種量：2%，6%，10%，14%和18%，最佳供氧量為裝液量150 mL三角瓶中分裝20,40,60,80和100 mL培養(yǎng)液，并在以上各條件下培養(yǎng)24 h后，測(cè)定OD600，明確最佳優(yōu)化條件。

100 L發(fā)酵罐放罐時(shí)間確定：在篩選得到的最佳培養(yǎng)基、溫度、轉(zhuǎn)速和供氧量等的基礎(chǔ)上，對(duì)生防菌株進(jìn)行100 L發(fā)酵罐連續(xù)放大培養(yǎng)，每隔3 h取樣，測(cè)定OD600，確定最佳放罐時(shí)間。

以上處理與對(duì)照均3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel2010，SPSS19.0等軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌株生物學(xué)特性的研究

2.1.1最低、最高、致死和最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定 菌株261MY6在低于4℃或高于56℃時(shí)菌株不再生長(zhǎng)，在95℃水浴10 min后涂于NA平板上48 h后未發(fā)現(xiàn)菌落，在28～36℃時(shí)OD600顯著高于其他溫度(P<0.05)。說(shuō)明菌株261MY6生長(zhǎng)最低、最高、致死和最適溫度分別均為4，56，95和28～36℃。

2.1.2菌株生長(zhǎng)pH值測(cè)定 由圖1知，菌株261MY6在pH值為4及以下時(shí)其生長(zhǎng)明顯受限，pH值為5～7時(shí)生長(zhǎng)良好，在pH值超過8時(shí)，生長(zhǎng)減緩，pH值達(dá)到11時(shí)，不再生長(zhǎng)。說(shuō)明261MY6菌株最適pH為5～7。

2.1.3菌株生長(zhǎng)曲線 菌株261MY6在0～5 h生長(zhǎng)不明顯，在5 h后均進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在10 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，約在30 h時(shí)菌株生物量上升到最大值，在34 h后進(jìn)入衰退期(圖2)。

圖2 生防菌株261MY6生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of the antagonistic strain 261MY6

2.2 碳、氮源及無(wú)機(jī)鹽離子的篩選

2.2.1碳、氮源及無(wú)機(jī)鹽離子種類的篩選 經(jīng)單因素試驗(yàn)篩選適宜生防菌株生長(zhǎng)所需的碳、氮源和無(wú)機(jī)鹽離子。菌株261MY6在碳源為乳糖時(shí)生物量(OD600)顯著大于其他碳源(P<0.05)(圖3)，說(shuō)明菌株261MY6生長(zhǎng)最適碳源為乳糖；菌株261MY6氮源為酵母膏時(shí)生物量(OD600)顯著高于其他氮源(P<0.05)，其中尿素對(duì)261MY6菌株的生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的抑制作用(圖4)，說(shuō)明菌株261MY6生長(zhǎng)最適氮源為酵母膏；菌株261MY6在無(wú)機(jī)鹽為MgSO4時(shí)生物量(OD600)顯著大于其他無(wú)機(jī)鹽(P<0.05)，而CuSO4與MnSO4對(duì)261MY6菌株有顯著的抑制作用(圖5)，說(shuō)明菌株261MY6生長(zhǎng)最適無(wú)機(jī)鹽為MgSO4。

圖3 碳源對(duì)生防菌株261MY6生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of carbon sources on the growth of antagonistic strain 261MY6注：小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同;1:蔗糖；2.玉米淀粉；3.可溶性淀粉；4.麥芽糖；5：乳糖；6：不加糖；7：CKNote:Lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below;1:Sucrose;2:Corn starch;3:Soluble starch;4:Maltose;5:Lactose;6:No Sugar;7:CK

圖4 氮源對(duì)生防菌株261MY6生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of nitrogen sources on the growth of antagonistic strain 261MY6注：1：尿素；2：(NH4)2SO4；3：KNO3；4：NH4Cl；5：酵母膏；6：不加氮；7:CKNote:1.Urea;2:(NH4)2SO4;3:KNO3;4:NH4Cl;5:Yeast Extract;6.No Nitrogen;7:CK

圖5 無(wú)機(jī)鹽對(duì)生防菌株261MY6生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of inorganic ions on the growth of antagonistic strain 261MY6注：1：MgSO4；2：KH2SO4；3：MnSO4；4：CuSO4；5：CaCl2；6：不加鹽；7：CKNote: 1：MgSO4；2：KH2SO4；3：MnSO4；4：CuSO4；5：CaCl2；6：No Ions；7：CK

2.2.2碳、氮源及無(wú)機(jī)鹽離子濃度的篩選 對(duì)2.2.1中篩選所得碳、氮源及無(wú)機(jī)鹽離子的濃度做進(jìn)一步優(yōu)化。菌株261MY6在碳源濃度乳糖25 g·L-1、氮源酵母膏濃度6 g·L-1和無(wú)機(jī)鹽濃度MgSO44 g·L-1時(shí)生物量(OD600)顯著高于其他濃度(P<0.05)，說(shuō)明菌株261MY6最適碳源濃度為乳糖25 g·L-1、氮源酵母膏濃度為6 g·L-1、無(wú)機(jī)鹽濃度為MgSO44 g·L-1(圖6,7,8)。

圖6 碳源濃度對(duì)生防菌株261MY6生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of concentrations of carbon sources

圖7 氮源濃度對(duì)菌株261MY6生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of concentrations of nitrogen sources on the growth of antagonistic

圖8 無(wú)機(jī)鹽離子濃度對(duì)菌株261MY6生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effect of concentrations of inorganic ions on the growth of antagonistic strain 261MY6

2.3 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)優(yōu)化了適宜菌株261MY6生長(zhǎng)的碳、氮源和無(wú)機(jī)鹽離子的濃度配比，菌株261MY6在乳糖25 g，酵母膏7 g，MgSO43 g，水1000 mL時(shí)生物量(OD600)顯著高于其他配比(P<0.05)。結(jié)果表明，最適菌株261MY6生長(zhǎng)的碳、氮源和無(wú)機(jī)鹽離子的濃度配比為牛肉膏3 g、乳糖25 g，MgSO43 g，酵母膏7 g，水1000 mL(表2)。

表2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table 2 Orthogonal tentative results

2.4 搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1最適pH值篩選 菌株261MY6在pH值為5和6時(shí)的生物量(OD600)差異不顯著(P>0.05)，此時(shí)生長(zhǎng)緩慢，到pH為7時(shí)生物量最高(OD600最大)，且顯著大于其他pH值下的生物量(P<0.05)，后又迅速下降；說(shuō)明了菌株261MY6生長(zhǎng)的最適pH值為7(圖9)。

圖9 pH對(duì)生防菌株261MY6生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effect of pH on the growth of antagonistic strain 261MY6

2.4.2最適溫度篩選 由圖10知，菌株261MY6的生物量在20～28℃之間隨著溫度的上升而升高，32℃時(shí)OD600達(dá)到最大，且OD600顯著大于其他溫度條件下的(P<0.05)。因此，適宜菌株261MY6的最適溫度為32℃。

2.4.3最佳接種量篩選 菌株261MY6在接種量

為14%時(shí)生物量(OD600)最大(P<0.05)(圖9)，說(shuō)明261MY6菌株生長(zhǎng)最適的接種量為14%(圖11)。

圖10 溫度對(duì)生防菌株261MY6生長(zhǎng)的影響Fig.10 Effect of temperature on the growth of antagonistic strain 261MY6

圖11 接種量對(duì)生防菌株261MY6生長(zhǎng)的影響Fig.11 Effect of inoculum on the growth of antagonistic strain 261MY6

2.4.4最佳裝液量篩選 如圖12，菌株261MY6在裝液量為40 mL·(150 mL)-1時(shí)生物量(OD600)最大，且與其他裝液量條件下的結(jié)果差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明生防菌株261MY6的最佳裝液量為40 mL·(150 mL)-1。

圖12 裝液量對(duì)生防菌株261MY6生長(zhǎng)的影響Fig.12 Effect of different liquid volume on the growth of antagonistic strain 261MY6

2.4.5最佳搖床轉(zhuǎn)速篩選 如圖13，菌株261MY6在搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到210 rpm時(shí)生物量(OD600)達(dá)到最大，且都顯著高于其他轉(zhuǎn)速時(shí)的生物量(P<0.05)，說(shuō)明菌株261MY6生長(zhǎng)最適的搖床轉(zhuǎn)速為210 rpm。

圖13 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)生防菌株261MY6生長(zhǎng)的影響Fig.13 Effect of different rotate speed on the growth of antagonistic strain 261MY6

2.5 100 L發(fā)酵罐放罐時(shí)間確定

在篩選好的最佳搖瓶發(fā)酵條件的前提下對(duì)生防菌株進(jìn)行100 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，并測(cè)定最佳的放罐時(shí)間，菌株261MY6延緩期較長(zhǎng)，在21 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，到30 h時(shí)生物量達(dá)到最大值，且顯著高于其他時(shí)段的生物量(OD600)(P<0.05)，之后直接進(jìn)入衰退期。說(shuō)明菌株261MY6的發(fā)酵罐最佳放罐時(shí)間為30 h (圖14)。

圖14 發(fā)酵時(shí)間對(duì)生防菌株261MY6生長(zhǎng)的影響Fig.14 Effect of different fermentation time on the growth of antagonistic strain 261MY6

3 結(jié)論與討論

解淀粉芽胞桿菌是芽胞桿菌屬細(xì)菌[13]，它能夠產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素IAA、溶磷、固氮，刺激作物生長(zhǎng)和誘導(dǎo)其防御系統(tǒng)產(chǎn)生抗性，同時(shí)分泌葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、甜蛋白、類甜蛋白、抗生素肽類物質(zhì)、伊枯草菌素、芬枯草菌素、表面活性素、芽胞素類和細(xì)菌素等抗菌活性物質(zhì)[14]，從而達(dá)到預(yù)防植物病害和抑制植物病原菌的作用[15-16]。目前，解淀粉芽胞桿菌已成為科研工作者的研究熱點(diǎn)，已有多種解淀粉芽胞桿菌菌株商品化。巴西Gertis Europe公司登記的解淀粉芽胞桿菌D747(Ecoshot)可防治柑橘雜色病毒(Phyllostictacitricarpa)、及多種作物的白粉病(Blumeriagraminisf.sp.tritici)、灰霉病(Botrytis.spp)以及莖腐病(F.graminearum)[17]；我國(guó)蘇科農(nóng)化公司登記解淀粉芽胞桿菌B1619和解淀粉芽孢桿菌Lx-11分別能夠有效防治番茄枯萎病(Fusarium.oxysporum)和水稻細(xì)菌性條斑病(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola, Xooc)[18]。本試驗(yàn)解淀粉芽胞桿菌261MY6對(duì)馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、馬鈴薯褐腐病菌(Stysanusstemonitis)、孜然根腐病菌(F.Solani)、黃瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、馬鈴薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)和番瓜根腐病菌(Fusariumsp.)等多種病原菌有良好的抑制作用，對(duì)開發(fā)生物農(nóng)藥有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。

解淀粉芽胞桿菌作為生防制劑用來(lái)防治植物病害，生物學(xué)特性的探究和培養(yǎng)條件優(yōu)化是制備生防制劑的重要手段，菌株生物學(xué)特性和培養(yǎng)基成分、溶氧量、pH、發(fā)酵時(shí)間以及搖床轉(zhuǎn)速等多種因素對(duì)產(chǎn)品性能發(fā)揮和產(chǎn)品的制備儲(chǔ)存均有較大的影響。研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌261MY6的生長(zhǎng)最適溫度范圍為28～36℃，最低生長(zhǎng)溫度4℃，最高生長(zhǎng)溫度56℃，致死溫度為95℃，最適pH值為5～7，該結(jié)果說(shuō)明菌株在4～56℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，且28～36℃的生長(zhǎng)效果最佳，菌株適宜范圍廣；最適pH5～7，說(shuō)明菌株適合在偏酸性的環(huán)境中生存。最優(yōu)培養(yǎng)基配比牛肉膏3 g，乳糖25 g，MgSO43 g，酵母膏7 g，水1 000 mL；最佳生長(zhǎng)條件：溫度32℃，接種量14%，裝液量40 mL·(150 mL)-1，搖床轉(zhuǎn)速210 rpm，pH 7，100 L發(fā)酵罐放罐時(shí)間30 h。此結(jié)果與魏立娟[19]和盧彩鴿等[20]報(bào)道的解淀粉芽胞桿菌的優(yōu)化結(jié)果較為相似，發(fā)酵時(shí)間比盧彩鴿等[20]報(bào)道的發(fā)酵時(shí)間縮短了五分之三，比于靚[21]等報(bào)道的培養(yǎng)溫度37℃低且最佳時(shí)間36 h少6 h，說(shuō)明解淀粉芽胞桿菌261MY6能在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量菌體，滿足生產(chǎn)要求，與張濤等[22]報(bào)道的相比碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽都不一樣，這可能與菌生存環(huán)境有一定的關(guān)系；經(jīng)過發(fā)酵工藝的優(yōu)化，解淀粉芽胞桿菌261MY6的生物量提高了將近6倍(發(fā)酵前最高的OD600為1.48，發(fā)酵后的OD600為8.24)，且活菌數(shù)達(dá)2.37×1012CFU·mL-1，發(fā)酵后菌量明顯比張榮勝等[23]和王法國(guó)等[24]報(bào)道的菌量高出許多。該結(jié)論為菌株261MY6進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。但本試驗(yàn)未對(duì)菌株261MY6的抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化和鑒定，此還有待于進(jìn)一步研究。