不同地區(qū)大曲中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離與鑒定

滿都拉，鄭逸飛，孫子羽，陳忠軍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 釀酒工程系，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

大曲是指以小麥、大麥和豌豆等為主要原料，經(jīng)粉碎、制坯和培菌制成的釀酒糖化劑和發(fā)酵劑，為長(zhǎng)方體形狀的粗酶制劑[1]，是一種囊括多種微生物和微生物酶的“多酶多菌共酵體系”[2]。在白酒生產(chǎn)中，大曲作為糖化發(fā)酵劑被大量使用，在某些類型的白酒生產(chǎn)中添加量甚至高達(dá)50%以上。大曲的產(chǎn)地、配方、原料、生產(chǎn)時(shí)間以及生產(chǎn)工藝的不同，會(huì)導(dǎo)致大曲的理化性質(zhì)不同[3-4]。這些理化性質(zhì)的差異，會(huì)導(dǎo)致微生物種類的差異[5-6]，直接影響成品酒的酒體風(fēng)格及品質(zhì)。業(yè)內(nèi)一直有“曲為酒之骨”的說法，可見大曲在白酒生產(chǎn)過程中的重要性。

大曲含有多種微生物，包括霉菌，酵母，細(xì)菌和少量放線菌，在這些微生物的共同作用下，使淀粉轉(zhuǎn)化成了酒精，并產(chǎn)生了復(fù)雜的風(fēng)味。研究顯示大曲中主要的細(xì)菌有 Lactobacillus、Bacillus、Staphylococcus 和Enterobacteriaceae 等屬[5-8]。其中 Bacillus 屬細(xì)菌可以產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶，能夠水解原料中淀粉和蛋白質(zhì)，在白酒的風(fēng)味方面有極重要的作用[9]。大曲的香氣是一種復(fù)合型香氣物質(zhì)，是在多種微生物共同作用下，經(jīng)過培菌發(fā)酵和入庫貯存兩個(gè)階段形成的[10]。相當(dāng)部分的香氣來源是細(xì)菌，例如生成濃香型白酒風(fēng)味主要香味成分己酸乙酯前體物質(zhì)己酸[11]，乙酸和乳酸等[12]。

不同地區(qū)的大曲的細(xì)菌種類及組成有較大差別，不同產(chǎn)區(qū)的大曲原料組成、工藝、氣候不同，是影響大曲中的細(xì)菌種類的重要因素。大曲作為白酒的主要原料之一，欲開發(fā)新產(chǎn)品，或者改良大曲，控制大曲中的細(xì)菌是一重要環(huán)節(jié)。為推動(dòng)大曲細(xì)菌菌群的研究，本文以不同地區(qū)大曲為研究對(duì)象，比較研究不同地區(qū)大曲中可培養(yǎng)細(xì)菌的種類，為進(jìn)一步研究大曲與白酒風(fēng)味形成機(jī)理及改良大曲提供材料及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3種大曲分別采自四川成都、山東濟(jì)寧和遼寧錦州某酒廠；胰蛋白胨、酵母提取粉、瓊脂（生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氯化鈉（優(yōu)級(jí)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；革蘭氏染液試劑盒：杭州微生物試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（trihydroxymethylaminomethane，Tris，≥99 %）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA，≥99%）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；冰醋酸（分析純）：天津化學(xué)試劑有限公司；DNA Marker（D2000）：天根生化科技（北京）有限公司；16SrDNA 引物（27f 與 1942R）及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒：生工生物（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2DF 雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DPX-9162B-1 恒溫培養(yǎng)箱：上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DYY-6D 臥式電泳儀、WD-9403X藍(lán)光觀察儀：北京六一生物科技有限公司；ABI Veriti96PCR 儀：賽默飛世爾科技公司；SCIENTZ-IID 超聲破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；NU-C200RE 離心機(jī)：NuAire Laboratory Equipment；pH 計(jì)（PB-10）：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DHG-9023A 烘干箱：上海篤特科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基及溶液配制

LB 固體培養(yǎng)基：1.0%胰蛋白胨、0.5%酵母提取粉、1.0%氯化鈉、2%瓊脂、pH 7.0、121℃滅菌 20 min；50×TAE 緩沖液：24.2% Tris、5.71 %冰醋酸（mL/mL）、3.72%EDTA；1×TAE 緩沖液：稀釋 50×TAE 緩沖液。

1.3.2 樣品處理

中間部位縱向切塊約100 g，包含曲皮到曲心的全部?jī)?nèi)容物，用研缽研碎后得大曲粉。

1.3.3 樣品pH 值測(cè)定

將1.0 g 大曲粉溶于100.0 mL 蒸餾水中，使用pH計(jì)測(cè)定pH 值。

1.3.4 樣品含水量測(cè)定

將10 g 大曲粉置于平皿中，稱重，烘至恒重，稱重，計(jì)算含水量。

1.3.5 樣品密度測(cè)定

將大曲塊用保鮮膜包裹做防水處理，置于裝有50.0 mL 水的100 mL 量筒中，使大曲塊完全沒入水面之下，讀取量筒水面高度，與初始液面高度的差值即為大曲塊體積，稱重獲得大曲塊質(zhì)量，計(jì)算密度。

1.3.6 可培養(yǎng)細(xì)菌分離

取大曲粉1.0 g 溶于無菌水中，振蕩混勻溶解；于試管中分別加注9.0 mL 蒸餾水滅菌后冷卻；在無菌操作臺(tái)使用移液槍吸取1.0 mL 樣本溶液于試管中，混勻，之后依次從前一試管中吸取1.0 mL 液體加入下一試管中混勻，稀釋到 10-5。選取 10-3、10-4、10-5，使用經(jīng)過滅菌的涂布棒在培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

1.3.7 可培養(yǎng)細(xì)菌純化

待稀釋涂布培養(yǎng)基菌落出現(xiàn)后，使用接菌環(huán)分別挑取每個(gè)平板上所有形態(tài)及顏色不同的單菌落進(jìn)行劃線，同時(shí)對(duì)這些菌落進(jìn)行記錄和編號(hào)；將培養(yǎng)皿置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。平板中長(zhǎng)出菌落后，挑取單菌落再次純化，重復(fù)3 次，3 次后若出現(xiàn)其他菌落，則繼續(xù)進(jìn)行純化，直到無雜菌出現(xiàn)。

1.3.8 可培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)觀察

滴一滴香柏油于載玻片的菌斑上，置于顯微鏡載物臺(tái)上觀察；調(diào)節(jié)顯微鏡直到視野內(nèi)出現(xiàn)清晰的單細(xì)胞，記錄革蘭氏染色特征，記錄菌體特征。

1.3.9 菌體收集

將純化后的細(xì)菌接種于液體LB 培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)菌液 OD600值達(dá)到 2.0 左右時(shí)，15 000 r/min 離心 1 min 獲得菌泥。

1.3.10 細(xì)胞破碎

分別利用兩種方式破碎細(xì)胞，反復(fù)凍融法：-80℃冷凍+90℃水浴反復(fù)凍融3 次；超聲破碎法：350 W 超聲破碎，5 s 工作+5 s 間歇，超聲破碎總工作時(shí)長(zhǎng)15 min，全過程30 min。

1.3.11 16SrRNA 擴(kuò)增及電泳

PCR 條件為：第一階段，94.0℃持續(xù) 10.0 min。第二階段，95.0℃持續(xù)0.5 s 后55.0℃持續(xù)0.5 s，再在72.0℃持續(xù)1 min 30 s。第二階段循環(huán)30 次。第三階段，72.0℃持續(xù) 10 min 后 16.0℃持續(xù)。PCR 完成后，將PCR 產(chǎn)物按順序加入瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中進(jìn)行電泳，電壓為120 V，電泳時(shí)間30 min。完成后置于藍(lán)光觀察儀下觀察條帶，根據(jù)Marker 確定片段長(zhǎng)度。

1.3.12 PCR 產(chǎn)物測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。序列返回后，登錄NCBI 網(wǎng)站利用BLAST工具進(jìn)行序列比對(duì)。利用MEGA7 軟件中的Neighbor joining Tree 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 含水量及密度的計(jì)算

1.4.1 含水量的計(jì)算

通過測(cè)定大曲初始質(zhì)量（m1）和烘干恒重質(zhì)量（m2），以下面公式計(jì)算大曲含水量（%）。

式中：M 為含水量，%；m1為初始質(zhì)量，g；m2為烘至恒重時(shí)質(zhì)量，g。

1.4.2 密度的計(jì)算

通過測(cè)定大曲質(zhì)量（m）和該質(zhì)量的體積（v），以下面公式計(jì)算大曲密度（g/cm3）。

式中：ρ 為密度，g/cm3；m 為質(zhì)量，g；v：體積，cm3。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)大曲基本理化指標(biāo)

不同地區(qū)大曲pH 值、含水量及密度等基本理化指標(biāo)見表1。

由表1可知四川成都大曲pH 值為6.99，含水量為9.89%，密度為0.71 g/cm3。山東濟(jì)寧大曲pH 值為6.16，含水量為10.00%，密度為0.68 g/cm3。遼寧錦州大曲pH值為6.58，含水量為11.65%，密度為0.86 g/cm3。山東濟(jì)寧大曲的pH 值最低，密度最低，四川成都大曲含水量最低，遼寧錦州大曲的密度和含水量最高。

表1 不同大曲基本理化指標(biāo)Table 1 Physical and chemical indicators of three dfferent Daqu

2.2 不同地區(qū)大曲中細(xì)菌的分離

3種大曲樣本中共分離出37 株可培養(yǎng)細(xì)菌。經(jīng)過進(jìn)一步確認(rèn)，四川成都大曲中分離出5 株，山東濟(jì)寧大曲中分離出4 株，遼寧錦州大曲分離出6 株形態(tài)不同的菌株，結(jié)果如表2所示。

表2 3種大曲中可培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞及菌落形態(tài)Table 2 The cell and colony morphology of the isolates from Daqu

續(xù)表2 3種大曲中可培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞及菌落形態(tài)Continue table 2 The cell and colony morphology of the isolates from Daqu

2.3 分離菌株16SrRNA擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

所分離微生物經(jīng)細(xì)胞破碎及PCR 擴(kuò)增后得到長(zhǎng)度約1 500 bp 序列，符合擴(kuò)增目的產(chǎn)物長(zhǎng)度。經(jīng)測(cè)序后，與數(shù)據(jù)庫中序列比對(duì)后，建立的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

圖1 不同地區(qū)大曲中分離細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree of cultivable bacteria in Daqu from different regions

從圖1中可知，四川成都大曲中可培養(yǎng)細(xì)菌發(fā)育樹分為兩個(gè)大簇。第一大簇包括Bacillu 和Staphylococcus 兩個(gè)屬。其中 Bacillus 屬中包括一株 B.licheniformis（DQA-3A5A）和兩株Bacillus 屬的細(xì)菌（DQA-3A3 和 DQA-4C3R），Staphylococcus 屬中一株菌屬于S.saprophyticus（DQA-3A7B）。第二大簇中僅有一個(gè)Pantoea 屬菌株（DQA-3A9R2）；山東濟(jì)寧大曲中可培養(yǎng)細(xì)菌發(fā)育樹同樣分兩個(gè)大簇。第一大簇中包括Bacillus 和Enterococcus 兩個(gè)屬，其中Bacillus 屬中包括 B.wiedmannii（DQB-A1BB）和 B.tequilensis（DQB-5A6R）兩個(gè)菌株，Enterococcus 屬中僅有一株E.lactis（DQB-5A2B）。第二大簇中僅包括一個(gè)Pseudomonas屬的細(xì)菌（DQB-5A1B）；遼寧錦州大曲中可培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)育樹也可分為兩個(gè)大簇。第一大簇中包括Acinetobacter 和 Enterococcuss 兩個(gè)屬，其中 DQC-B1、DQCC1 和 DQC-C2 均屬 Acinetobacter，DQC-B4 屬于 Enterococcuss 屬的E.faecalis。第二大簇中兩株菌（DQCA1 和 DQC-B3）均屬于 Enterobacter 屬細(xì)菌。

3 討論與結(jié)論

不同原料、生產(chǎn)環(huán)境及生產(chǎn)時(shí)間對(duì)大曲中微生物均有影響[5-6，13]。本研究中從四川成都大曲中分離出細(xì)菌中有3 株屬于Bacillus 屬，其中DQA-3A5A 是一株B.licheniformis。報(bào)道顯示該類細(xì)菌可以分泌多種具有淀粉水解能力的酶，促進(jìn)淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)榭砂l(fā)酵糖類，作為酒精發(fā)酵階段產(chǎn)生底物[2]。另外，Bacillus 屬細(xì)菌可在固態(tài)發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生苯乙醛、糠醛、庚醇、呋喃扭爾、4-甲基-2，6-二叔丁基-苯酚、吲哚、2-戊基呋喃、三甲基吡嗪、2，3-丁二醇、異戊酸、苯甲醛、2-甲基-2-丁烯酸、四甲基吡嗪、β-苯乙醇和苯乙酸等多種風(fēng)味物質(zhì)[14]。因此，Bacillus 屬細(xì)菌在白酒固態(tài)發(fā)酵過程中起到的重要作用。DQA-3A9R2 是一株P(guān)antoea 屬細(xì)菌，該屬細(xì)菌多見于植物中，是一類條件致病菌。劉洋等[15]在超級(jí)水稻種子中發(fā)現(xiàn)該類細(xì)菌是超級(jí)水稻種子中的主要優(yōu)勢(shì)菌種，所以該類微生物或由谷物原料帶入。DQA-3A7B 是一株S.saprophyticus，是肉類發(fā)酵食品中的常見微生物之一[16]。竇曉等在研究瀘香型大曲中也發(fā)現(xiàn)了該類微生物[17]。

在山東濟(jì)寧大曲中發(fā)現(xiàn)B.wiedmannii 和B.tequilensis 兩株芽孢桿菌屬細(xì)菌。芽孢桿菌（B.wiedmannii）在大曲中是一類極重要的細(xì)菌，占菌群數(shù)量的50%以上。B.tequilensis可分泌 β-1，3-1，4-葡聚糖酶，該酶可以對(duì)β-葡聚糖進(jìn)行分割，破碎禾本植物種子的胚乳細(xì)胞壁，使禾本植物胚乳中的淀粉充分釋放出來參與發(fā)酵，在固態(tài)發(fā)酵過程中起重要輔助作用[18]。乳酸菌（Lactobacillus）是大曲中的常見菌[19]。E.lactis（DQB-5A2B）屬乳酸菌，在固態(tài)發(fā)酵的過程中，如果乳酸菌生成適量乳酸，通過蒸餾進(jìn)入酒體后，有利于改善白酒的風(fēng)味。這種情況下，乳酸菌可歸屬于白酒釀造有益細(xì)菌[20]。但是，如果料醅中的乳酸菌過多，活力較強(qiáng)，加上環(huán)境溫度等條件適宜，將會(huì)產(chǎn)生過多的乳酸，生成乳酸乙酯較多，導(dǎo)致白酒的口感較差，此時(shí)的乳酸菌可被視為有害細(xì)菌[21]。Pseudomonas（DQB-5A1B）屬細(xì)菌一般是條件致病菌，經(jīng)常導(dǎo)致制曲工人出現(xiàn)皮膚感染等職業(yè)病。遼寧錦州產(chǎn)大曲中發(fā)現(xiàn)多株Acinetobacter 屬，其中 DQC-B1，DQC-C1 和 DQC-C2 均為 A.johnsonii，該屬細(xì)菌廣泛存在于環(huán)境中，耐受性較強(qiáng)。報(bào)道顯示，Acinetobacter 屬主要出現(xiàn)在管路和器械的表面中[22]。E.faecalis（DQC-B4）多見于植物發(fā)酵食品中，例如泡菜等，也是一種條件致病菌。在植物發(fā)酵食品有害微生物安全分析研究中發(fā)現(xiàn)，E.faecalis 在葉菜類和果菜類食品中檢出數(shù)較多[23]。

綜上所述，不同地區(qū)、原料對(duì)大曲中可培養(yǎng)微生物影響較大，芽孢桿菌是常見的一類存在于大曲中的微生物，能夠提供多種酶類，是發(fā)酵有益菌。但在傳統(tǒng)制曲過程中一些治病或非發(fā)酵細(xì)菌也在本研究中發(fā)現(xiàn)。因此，優(yōu)化生產(chǎn)工藝提高有益微生物量，降低不利微生物的繁殖是進(jìn)一步優(yōu)化傳統(tǒng)大曲的一個(gè)研究方向。