德式乳桿菌QS306產(chǎn)胞外多糖的特性研究

李艷，吳楠，雙全，*

（1.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市伊金霍洛旗食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017200；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）是指微生物細(xì)胞內(nèi)合成之后分泌到細(xì)胞外的一類活性多糖[1]。是一種能夠溶解或分散在水中的長鏈高分子聚合物，并且具有良好的增稠和膠體性質(zhì)，由于其良好的物理學(xué)特性和流變學(xué)特性，微生物的胞外多糖成為研究與開發(fā)的熱點(diǎn)[2]。

乳酸菌是被公認(rèn)的安全食用菌株，也是公認(rèn)的綠色安全的微生物[3]，是一種優(yōu)質(zhì)的益生菌[4]，乳酸菌分布廣泛[5]，乳酸菌所產(chǎn)胞外多糖具有良好的物理學(xué)特性和生物學(xué)活性[6]，應(yīng)用于各種酸乳和干酪等發(fā)酵乳制品的加工和生產(chǎn)過程中，乳酸菌之所以能夠改善和提高其風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)和營養(yǎng)保健特性，主要是通過乳酸菌代謝過程中所產(chǎn)胞外多糖來完成的[7]。

能產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌具有改變食品風(fēng)味，提高食品保藏性能，提高食品的營養(yǎng)價值，還具有平衡腸道微生物，抗病毒、降血脂、促進(jìn)消化、抗氧化、抑菌抗病等作用[8]。近幾十年來，由于胞外多糖在產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、功能及生產(chǎn)等方面具有的特別優(yōu)勢，乳酸菌胞外多糖的研究成為了乳酸菌的研究熱點(diǎn)[9]。

研究發(fā)現(xiàn)EPS 具有一定的益生元功效，可以對動物、人體等腸道中的菌群有良好的刺激作用，有助于動物和人類對食物的吸收和消化，EPS 具有良好的流變學(xué)特性，大大地增加了食品的黏度，使得發(fā)酵乳制品能夠在胃腸道內(nèi)存留的時間更長，所以對腸道內(nèi)的益生菌十分有益，因此更具有實(shí)用價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 材料

德氏乳桿菌QS306：由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院民族特色功能食品研發(fā)團(tuán)隊(duì)提供。

葡萄糖、濃硫酸、三氯乙酸、抗壞血酸、無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、95%乙醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、苯酚、鐵氰化鉀：天津南開允公合成技術(shù)有限公司；DPPH、磷酸鹽緩沖溶液（磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉）、三氯化鐵：天津風(fēng)船化學(xué)試劑；透析袋：Coolaber；MRS 培養(yǎng)基：Solarbio；所有試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

GZX-9076 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海啟威電子有限公司；U-5100 UV/VIS 紫外可見分光光度計：Hitachi High-Tech Science Corporation Tokyo Japan HITACHI；AL204 電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；G8023GL-K3 微波爐：格蘭仕集團(tuán)；SHZ-D 循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；PHS-3C 型數(shù)顯酸度計：中國雷磁分析儀器廠；MX-F 快速混勻器：金壇市富華儀器有限公司；SW-CJ-2DF 超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；RV10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA 公司；MYLAB 通風(fēng)櫥：北京鳴遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)家具公司；cMedia 微波爐：中國美的公司；KDC-140HR 高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；WPL-230BE 電熱恒溫培養(yǎng)箱：AISIFE 公司；HH.S11-Ni2 電熱恒溫水浴鍋：北京長安科學(xué)儀器廠；JY1002 電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；SPX-1500 型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BCD-215kan：青島海爾有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌胞外多糖分離提取步驟

供試菌株→活化→37℃恒溫培養(yǎng)48 h→沸水浴使酶類失活→調(diào)pH 值至4.6 除酪蛋白→加入三氯乙酸（80%）→離心（10 000 r/min，20 min，4℃）除蛋白→4℃靜置24 h→濃縮上清液→離心除蛋白→4℃靜置20 h→離心（10 000 r/min，4℃，20 min）收集上清→醇沉24 h→離心收集沉淀→去離子水溶解沉淀→透析24 h→收集胞外多糖。

1.2.2 菌株QS306 胞外多糖含量的測定

1.2.2.1 菌株QS306 胞外多糖的提取

方法參照陳芳等[10]和邵麗[11]，方法同1.2.1。

1.2.2.2 菌株胞外多糖含量測定

方法參照李盛鈺等[12]的苯酚硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制步驟如表1所示。

按表1所示添加試劑，立即搖勻，室溫下靜置30 min。490 nm 處測定吸光值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算胞外多糖產(chǎn)量。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法Table 1 Glucose standard curve drawing method

1.2.3 菌株QS306 胞外多糖的抗氧化活性測定

1.2.3.1 菌株QS306所產(chǎn)EPS 對DPPH·清除活性的測定

參照崔學(xué)敏等[13]方法并稍作修改，具體方法如表2所示。

表2 DPPH·清除活性的測定方法Table 2 Determination of DPPH free radical scavenging activity

按表2所示添加試劑，混勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm 處測定吸光值（調(diào)零：無水乙醇，對照：蒸餾水），以VC為陽性對照，計算清除率。

式中：A0為對照溶液的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度。

1.2.3.2 菌株QS306所產(chǎn)EPS 對·OH 的清除活性的測定

方法參照賈紅倩等[14]，具體步驟如表3所示。

表3 ·OH 的清除活性測定方法Table 3 Determination of OH free radical scavenging activity

按表3所示添加試劑，混勻后，37℃水浴30 min，4 000 r/min 離心 10 min，于 510 nm 處測吸光值，用蒸餾水作為對照，以VC為陽性對照。

式中：A0為不加樣品溶液的吸光度；A1為加入樣品溶液的吸光度；A2為不加過氧化氫的吸光度。

1.2.3.3 菌株QS306所產(chǎn)EPS 還原力的測定

參照張海霞等[15]方法并稍作修改，采用鐵氰化鉀法，具體方法如表4所示。

表4 EPS 還原力的測定方法Table 4 Determination of EPS reduction force

按表4所示添加試劑，搖勻，靜置10 min，于700 nm 處測吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株QS306所產(chǎn)胞外多糖的產(chǎn)量

菌株QS306所產(chǎn)胞外多糖的產(chǎn)量測定所用的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

由圖1可知，在脫脂乳培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株QS306 產(chǎn)胞外多糖的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=16.594x+0.033 9，其中 R2=0.999 8，根據(jù)此回歸方程，可知在脫脂乳培養(yǎng)基中胞外多糖的產(chǎn)量為0.598 mg/mL，在MRS 培養(yǎng)基中胞外多糖的產(chǎn)量為0.13 mg/mL；所以脫脂乳培養(yǎng)基中胞外多糖的產(chǎn)量相對于MRS 培養(yǎng)基中含量更高，可能是因?yàn)槊撝榕囵B(yǎng)基中乳糖含量高，菌株QS306 在生長過程中對乳糖進(jìn)行充分的利用，可能由此提高其胞外多糖的產(chǎn)量；而MRS 培養(yǎng)基中葡萄糖的利用率和分解量較低，可能是胞外多糖在MRS 培養(yǎng)基中產(chǎn)量較低的影響因素，所以，以乳糖為碳源的脫脂乳培養(yǎng)基相對于以葡萄糖為碳源的MRS培養(yǎng)基更具有提高胞外多糖產(chǎn)量的優(yōu)勢，此外，在試驗(yàn)過程中大量的乳清提取液中豐富的乳清蛋白也是影響其胞外多糖產(chǎn)量的重要因素[16]。

2.2 菌株QS306的抗氧化特性

2.2.1 胞外多糖對DPPH 自由基的清除活性

菌株QS306所產(chǎn)胞外多糖對DPPH 自由基的清除活性如圖2、圖3所示。

圖2 MRS 培養(yǎng)基所產(chǎn)胞外多糖對DPPH 自由基的清除率Fig.2 Scavenging activity of DPPH free radicals from exopoly saccharides produced by MRS medium

圖3 脫脂乳培養(yǎng)基所產(chǎn)胞外多糖對DPPH 自由基的清除率Fig.3 Scavenging activity of DPPH free radicals from exopoly saccharides produced by skim milk culture medium

由圖2、圖3可知，通過測定胞外多糖清除DPPH自由基的吸光度減小值來計算清除率等參數(shù)，反映了胞外多糖抗氧化能力的強(qiáng)弱。MRS 培養(yǎng)基中的胞外多糖對DPPH 自由基的清除能力比同濃度VC的清除能力差，可能是由于其所產(chǎn)胞外多糖含量少濃度低，而導(dǎo)致其清除能力差。脫脂乳培養(yǎng)基的濃度越大其所產(chǎn)的胞外多糖對DPPH 自由基的清除活性越強(qiáng)，所以胞外多糖濃度的大小對其DPPH 自由基清除活力呈正相關(guān)性；在脫脂乳中胞外多糖的濃度為0～9.6 μg/mL 時，其DPPH 自由基的清除活性高于同濃度VC的清除活性；在濃度為2.4 μg/mL 時，脫脂乳培養(yǎng)基中的胞外多糖對DPPH 自由基的清除率為20.3%，而同濃度VC的清除率僅僅為7.86%，相比而言脫脂乳中胞外多糖對DPPH 自由基的清除能力較好；當(dāng)胞外多糖的濃度大于9.6 μg/mL 時，其DPPH 自由基清除活性相對于同濃度VC沒有明顯的上升趨勢，可能是由于胞外多糖的濃度過高，當(dāng)胞外多糖濃度等于A 時，定量的DPPH乙醇溶液已與胞外多糖完全反應(yīng)，DPPH 自由基基本完全清除，所以當(dāng)多糖濃度大于A 時清除能力無明顯上升趨勢，由此可以證明脫脂乳培養(yǎng)基中所產(chǎn)胞外多糖含量多濃度高，以上結(jié)果與文獻(xiàn)所述一致[17]。

2.2.2 胞外多糖對·OH 自由基的清除活性

菌株QS306所產(chǎn)胞外多糖對·OH 的清除活性如圖4、圖5所示。

圖4 MRS 培養(yǎng)基所產(chǎn)胞外多糖對·OH 的清除率Fig.4 The scavenging activity of OH radicals produced by the exopoly saccharides produced by MRS medium

圖5 脫脂乳培養(yǎng)基所產(chǎn)胞外多糖對·OH 的清除率Fig.5 The scavenging activity of exopoly saccharides produced by skim milk culture medium for OH radicals

由圖4、圖5可知，通過測定H2O2加入前后的吸光度值的變化來計算清除率，以判斷樣品清除·OH 能力。MRS 培養(yǎng)基中胞外多糖對·OH 的清除能力相對于同濃度VC的清除能力較弱。脫脂乳培養(yǎng)基中當(dāng)胞外多糖濃度小于等于B 時其·OH 的清除能力雖有明顯的上升趨勢，但相對于同濃度VC仍較低，在上升過程中C 點(diǎn)突然升高可能是由于誤差導(dǎo)致；當(dāng)多糖濃度為76.8 μg/mL 時，其對·OH 的清除能力為 94.9%，而同濃度VC的清除能力為82.65%，所以當(dāng)胞外多糖濃度大于B 時其·OH 的清除活力比VC強(qiáng)，以此證明脫脂乳中所產(chǎn)胞外多糖的含量和其對·OH 的清除能力較好，含量與其·OH 清除能力可能呈正相關(guān)性。

2.2.3 胞外多糖的還原力

菌株QS306所產(chǎn)胞外多糖的還原力如圖6、圖7所示。

圖6 MRS 培養(yǎng)基所產(chǎn)的胞外多糖的還原力Fig.6 The reducing power of exopoly saccharides produced by MRS medium

圖7 脫脂乳培養(yǎng)基所產(chǎn)的胞外多糖的還原力Fig.7 The reducing power of exopoly saccharides produced by skim milk medium

由圖6、圖7可知，MRS 和脫脂乳培養(yǎng)基中胞外多糖對鐵氰化鉀的還原力逐漸增強(qiáng)，隨著濃度的不斷增大，其還原力都呈上升趨勢。由圖6所示，MRS 培養(yǎng)基中胞外多糖的還原能力雖呈一定的上升趨勢，但隨胞外多糖濃度的增大其上升趨勢逐漸趨于平緩，可能與其胞外多糖濃度低有關(guān)。如圖7所示，脫脂乳培養(yǎng)及中胞外多糖的還原能力呈明顯的上升趨勢，且其吸光值隨胞外多糖濃度的增大而明顯上升，說明脫脂乳中胞外多糖的濃度較高，所以其還原力較強(qiáng)。

3 結(jié)論

菌株QS306 在脫脂乳培養(yǎng)基和MRS 培養(yǎng)基中胞外多糖的產(chǎn)量分別為598 mg/L 和130 mg/L，脫脂乳中的胞外多糖含量約是MRS中的4.5 倍。

菌株QS306 的抗氧化活性測定結(jié)果表明，脫脂乳培養(yǎng)基中所產(chǎn)的胞外多糖對DPPH 自由基的清除能力為47.20%，MRS 培養(yǎng)基中的胞外多糖對DPPH 自由基的清除能力為7.63%；脫脂乳中·OH 的清除能力為80.30%，MRS 培養(yǎng)基中·OH 的清除能力為10.13 %；脫脂乳培養(yǎng)基中胞外多糖的還原力也相對較強(qiáng)。所以脫脂乳中所產(chǎn)胞外多糖的抗氧化活性明顯高于MRS。這說明德氏乳桿菌QS306 在發(fā)酵脫脂乳培養(yǎng)基中所產(chǎn)的胞外多糖含量高，抗氧化活性好，具有深入的研究和開發(fā)價值。