UPLC-MS/MS測定食品中18種非食用色素的研究

唐俊，曾凱，劉志斌

（1.南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330096；2.南昌市食品安全檢測與控制重點(diǎn)實驗室，江西 南昌 330096）

工業(yè)染料具有高毒、致畸、致突變等危害[1-2]，被明令禁止在食品中使用。辣椒醬顏色鮮艷，色素含量高，是可能違法使用工業(yè)染料的高風(fēng)險產(chǎn)品。我國現(xiàn)行非食用色素檢測標(biāo)準(zhǔn)一般只檢測一種或少數(shù)幾種，這些標(biāo)準(zhǔn)[3-5]還存在難適用復(fù)雜基質(zhì)食品、試劑消耗量大、效率低等問題。因此，建立一次性檢測多種非食用色素，才能對食品中添加非食用色素的違法行為進(jìn)行有效的監(jiān)控。

QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe）方法是近年來國際上發(fā)展起來的一種快速樣品前處理技術(shù)，由美國農(nóng)業(yè)部于2003年開發(fā)的，最初用于農(nóng)藥殘留的檢測[6]。原理與高效液相色譜和固相萃取相似，都是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化的目的。QuEChERS 方法與傳統(tǒng)方法比較具有回收率高、精確度和準(zhǔn)確度高、可分析的農(nóng)藥范圍廣、分析速度快、溶劑使用量少，污染小，價格低廉、操作簡便等優(yōu)勢，越來越多的替代傳統(tǒng)液液萃取、固相萃取、凝膠滲透凈化等前處理方法[7-10]。

本研究建立一套基于QuEChERS-液質(zhì)聯(lián)用同時分析辣椒醬中的18種非食用色素（羅丹明B、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、蘇丹紅I～I(xiàn)V、蘇丹紅G、蘇丹橙G、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、甲苯胺紅、分散紅1、分散橙3、分散黃3、堿性橙II、堿性嫩黃O、堿性紅2）的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

1290-6460 超高效液相三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 公司；XS205 DualRange 十萬分之一天平：Mettler Toledo 公司；TDL-5 離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

羅丹明 B（95.0%）、孔雀石綠（95.0%）、隱色孔雀石綠（98.0%）、蘇丹紅Ⅰ（95.0%）、蘇丹紅Ⅱ（90.0%）、蘇丹紅Ⅲ（85.0 %）、蘇丹紅 G（90.0 %）、堿性橙 II（98.0 %）、堿性嫩黃 O（80.0%）、隱色結(jié)晶紫（98.0%）、無水硫酸鎂、氯化鈉、C18（硅膠）吸附劑：上海安譜實驗科技股份有限公司；分散橙3（95.0 %）、分散黃3（99.0%）、堿性紅 2（93.4%）、蘇丹紅Ⅳ（99.0%）、蘇丹橙G（98.6 %）、甲苯胺紅（68.0 %）：Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；結(jié)晶紫（90%）：Alfa Aesar 公司；分散紅 1（95%）：ALDRICH 公司；甲醇、乙腈：色譜純，Merck 公司；乙酸銨、甲酸：99 %，LCMS/HPLC，ANROUR CHEMICALS SUPPLY 公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量各色素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解，得到濃度為100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，避光于4℃下保存。使用時用乙腈稀釋成 10、20、40、80、120、200 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取5.0g 樣品于50mL 離心管中，加入10 mL水，渦旋2 min，加入10 mL 乙腈和1 g 氯化鈉渦旋提取 2 min，5 000 r/min 離心 5 min。取 2 mL 上清液，加入到裝有50 mg C18和100 mg 無水硫酸鎂的5 mL 離心管中，渦旋1 min，8 000 r/min 離心 5 min，含油脂樣品于-20℃冷凍2 h，取乙腈層過0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜，濾液供超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測。

1.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：Eclipse-plus C18（3.0×150 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40℃；流速：0.3 mL/min；流動相：A：5 mmol/L 乙酸銨-0.1%甲酸混合水溶液，B：甲醇；梯度洗脫條件見表1。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI 正模式；霧化氣：氮?dú)?；霧化氣壓力：0.28 Pa；離子噴霧電壓：4 500 V；干燥氣溫度：350℃，干燥氣流速：11 L/min；電子倍增器電壓：200 V。18種色素質(zhì)譜分析條件見表2。

表1 液相梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of HPLC

表2 18種非食用色素質(zhì)譜分析條件Table 2 MS parameters of 18 non-edible pigments

續(xù)表2 18種非食用色素質(zhì)譜分析條件Continue table 2 MS parameters of 18 non-edible pigments

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS 技術(shù)常用的吸附劑有N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、C18（硅膠）、石墨化碳（graphitizable carbon，GCB），由于這些色素都具有六元環(huán)結(jié)構(gòu)，極易被GCB 吸附，因而不能用其作為凈化吸附劑。綜合前期試驗及文獻(xiàn)，選定C18作為本試驗吸附劑，通過比較用量為25、50、100 mg C18的凈化效果和目標(biāo)物回收率水平，確定50 mg C18為最佳用量。以空白辣椒醬為基質(zhì)，添加量為200 μg/kg，兩次平行試驗取平均值，各吸附劑用量的回收率結(jié)果見表3。

表3 吸附劑用量對回收率的影響Table 3 Effect of adsorbent dosage on recovery rate

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

液質(zhì)聯(lián)用法較液相色譜法更加靈敏，且可以同時實現(xiàn)多種化合物的高通量檢測。以濃度為1 mg/L 的色素單標(biāo)做為待測物，進(jìn)樣量為10 μL，目標(biāo)物不經(jīng)過色譜柱直接進(jìn)入質(zhì)譜，首先對目標(biāo)物進(jìn)行全掃描，確定每種色素的電離方式和分子離子峰；然后再運(yùn)用子離子掃描模式將母離子打碎對子離子進(jìn)行掃描，優(yōu)化裂解電壓和碰撞能量，選取兩個豐度比較高的子離子分別作為定性和定量離子；最終建立的18種色素的多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式的最佳質(zhì)譜條件（見表2）。根據(jù)各色素保留時間的不同，將其分為4組進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以保證所檢測的各化合物都有足夠的數(shù)據(jù)采集點(diǎn)，從而提高M(jìn)RM 信號的響應(yīng)強(qiáng)度。18種色素的MRM 譜圖見圖1。

圖1 18種非食用色素的MRM 譜圖Fig.1 MRM spectra of 18 non-edible pigments

2.3 方法的線性范圍、檢出限、定量下限、回收率與精密度

用空白基質(zhì)提取液配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列，以選定的定量離子峰面積Y 對含量X（μg/L）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，18種非食用色素的線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2。同時用空白基質(zhì)提取液繼續(xù)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)系列的最低點(diǎn)，直到獲得 3 倍（S/N=3）、10 倍（S/N=10）信噪比濃度，確定其為該非食用色素的檢出限和定量限，見表4。

添加2個不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平取5 份樣品進(jìn)行試驗，計算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表 4。由表4可以看出，18種非食用色素的回收率為80.2%～109.2%，RSD 為2.4%～9.7%。

表4 18種非食用色素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 4 Linear ranges，correlation coefficients，litmits of detection，litmits of quantiflcation，recoveries and relative standard deviations of 18 non-edible pigments（n=5）

3 結(jié)論

本研究解決目前國內(nèi)缺乏同時測定多種非食用色素方法的問題，建立了一次性檢測辣椒醬中18種非食用色素的有效方法。本方法與傳統(tǒng)方法相比檢驗時間縮短50%以上，試劑消耗減少50%以上，具有簡單高效、快速準(zhǔn)確、環(huán)境友好的優(yōu)勢，滿足辣椒醬中非法添加非食用色素的實際監(jiān)測的分析需求。