植物乳桿菌對(duì)獼猴桃果酒品質(zhì)影響的評(píng)價(jià)

葛東穎，李華佳，劉雪婷，楊成聰，陳欣蕾，郭壯，*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066）

作為呼吸躍變型水果，獼猴桃采摘后不易保藏和運(yùn)輸，長(zhǎng)時(shí)間貯藏易變軟和腐敗變質(zhì)，因此對(duì)其進(jìn)行深加工則顯得尤為重要[1]。獼猴桃果酒作為獼猴桃深加工的產(chǎn)品，不僅具有濃郁醇厚的酒香，其VC的含量也相對(duì)較高，具有較好的保健作用[2]。但目前獼猴桃果酒的市場(chǎng)接受度卻并不高，究其原因在于獼猴桃果酒的酸度過(guò)高，消費(fèi)者難以接受[3]。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的眾多研究者都致力于借助蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）來(lái)降低果酒中的酸度[4]。

在MLF 發(fā)酵過(guò)程中，酒類(lèi)酒球菌（Oenococcus oeni）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）可以把口感尖銳的蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化為口感圓潤(rùn)的乳酸，從而實(shí)現(xiàn)了果酒酸度的降低[5]。然而目前商業(yè)化的O.oeni 生長(zhǎng)緩慢且對(duì)于環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)的要求較高，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，延緩了工業(yè)化生產(chǎn)周期，增加了污染的潛在可能性[6]，L.plantarum 對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)、生產(chǎn)速度快，使獼猴桃果酒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成為了可能[7]。電子舌和電子鼻技術(shù)在食品品質(zhì)的評(píng)價(jià)方面具有廣泛的應(yīng)用，不僅可以快速的對(duì)食品滋味和風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行分析，而且具有不受主觀因素影響的優(yōu)點(diǎn)[8]，兩種技術(shù)相結(jié)合目前在紅酒[9-10]、橄欖油[11]、櫻桃番茄汁[12]和魚(yú)肉[13]的品質(zhì)評(píng)價(jià)中有著廣泛的應(yīng)用。

本研究以鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品菌種資源庫(kù)中39株L.plantarum（植物乳桿菌）為依托，將其與酵母菌混合發(fā)酵進(jìn)行獼猴桃果酒制備，并使用電子舌和電子鼻相結(jié)合的手段對(duì)獼猴桃果酒的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)結(jié)合高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術(shù)對(duì)果酒中有機(jī)酸構(gòu)成進(jìn)行了分析，以期從中篩選出發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株用于后續(xù)獼猴桃果酒的生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

徐香獼猴桃：市售；39 株L.plantarum（植物乳桿菌）：由湖北文理學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品菌種資源庫(kù)提供，其中1號(hào)～5號(hào)菌株編號(hào)為HBUAS52005、HBUAS52006、HBUAS52007、HBUAS52008 和 HBUAS52010，6～10號(hào)菌株編號(hào)為 HBUAS52015、HBUAS-52016、HBUAS52017、HBUAS52018 和 HBUAS52019，11號(hào)～15號(hào)菌株編號(hào)為 HBUAS52020、HBUAS52154、HBUAS52168、HBUAS52173和HBUAS52175，16號(hào)～20號(hào)菌株編號(hào)為 HBUAS52151、HBUAS52153、HBUAS52155、HBUAS52166 和 HBUAS52158，21號(hào)～25號(hào)菌株編號(hào)為HBUAS52340、HBUAS52336、HBUAS52337、HBUAS5 -2343 和 HBUAS52345，26號(hào)～30號(hào)菌株編號(hào)為HBUAS-52346、HBUAS52350、HBUAS52333、HBUAS5232 1 和HBUAS52323，31號(hào)～35號(hào)菌株編號(hào)為 HBUAS52324、HBUAS52328、HBUAS52352、HBUAS52339 和HBUAS-52322，36號(hào)～39號(hào)菌株編號(hào)為 HBUAS52325、HBUAS-52327、HBUAS52354 和 HBUAS52356；RW 葡萄酒·果酒專(zhuān)用酵母：安琪酵母股份有限公司；甲醇（色譜純）、異丙醇（色譜純）、磷酸二氫鉀（優(yōu)級(jí)純）、奎寧酸（優(yōu)級(jí)純）、蘋(píng)果酸（優(yōu)級(jí)純）、乳酸（優(yōu)級(jí)純）、檸檬酸（優(yōu)級(jí)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉：分析純，天津市化學(xué)試劑研究所有限公司；國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；果膠酶（5 萬(wàn) U/g）、偏重亞硫酸鉀：食品級(jí)，煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；參比溶液、陽(yáng)離子溶液、預(yù)處理溶液、陰離子溶液、內(nèi)部溶液：日本INSENT 公司。

SA 402B 電子舌（配備2個(gè)參比電極和5個(gè)味覺(jué)傳感器）：日本 Insent 公司；PEN3 電子鼻（配備 10個(gè)金屬傳感器）：德國(guó)Airsense 公司；LC-20ADXR 高效液相色譜儀、InertSustainSwift C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SPD-M20A 二極管陣列檢測(cè)器：日本島津公司；CR21N 高速離心機(jī)：日本日立公司；250B 數(shù)顯生化培養(yǎng)箱：金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 獼猴桃果酒的制作

選擇相同成熟度且無(wú)變質(zhì)的獼猴桃去皮后破碎入罐，按添加0.10 mg/L 偏重亞硫酸鉀和0.06%的果膠酶，攪拌均勻后使用白砂糖調(diào)節(jié)糖度至22°Brix，接種酵母6 h 后分裝為40 罐，按照106CFU/mL 獼猴桃酒添加量分別接入 39 株 L.plantarum 于 22℃發(fā)酵 7 d 后18℃后發(fā)酵20 d，樣品5 000 r/min 離心10 min 取上清液待用[14]。設(shè)置不添加L.plantarum 的樣品為對(duì)照組。

1.2.2 基于電子舌獼猴桃果酒的滋味品質(zhì)評(píng)價(jià)

參考王玉榮等[15]和郭壯等[16]對(duì)米酒滋味品質(zhì)測(cè)定的條件并做適當(dāng)優(yōu)化。取40 mL 果酒樣品和80 mL 蒸餾水混合均勻后10 000 r/min 離心10 min，取上清液抽濾待用。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定4 次，取后3 次數(shù)據(jù)為試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.3 基于電子鼻獼猴桃果酒的風(fēng)味品質(zhì)評(píng)價(jià)

參考張振等[17]和徐晚秀等[18]對(duì)黃酒和白酒風(fēng)味品質(zhì)測(cè)定的條件并做適當(dāng)優(yōu)化。取10 mL 果酒樣品于電子鼻樣品瓶中，50℃保溫30 min，室溫靜置10 min 后插入電子鼻探頭進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定3 次。響應(yīng)曲線在 60 s 后達(dá)到穩(wěn)定，選取 69、70 s 和 71 s 的響應(yīng)值，并計(jì)算其平均值為測(cè)試值。

1.2.4 基于HPLC 獼猴桃果酒中有機(jī)酸測(cè)定

參考王剛等[19]和楊成聰?shù)萚20]對(duì)獼猴桃果酒和米酒有機(jī)酸測(cè)定的條件并做適當(dāng)優(yōu)化，對(duì)獼猴桃果酒中奎寧酸、乳酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸的含量進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確吸取2 mL 果酒樣品于10 mL 容量瓶中，加入0.2 mL 的0.1 mol/L 的磷酸溶液后用流動(dòng)相定容，過(guò)0.22 μm 針孔濾膜待用。參數(shù)設(shè)置：流動(dòng)相為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（pH 2.50），柱溫 30℃，流速 1.0 mL/min，檢測(cè)器為二極管陣列紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm。采用保留時(shí)間對(duì)果酒中4種有機(jī)酸進(jìn)行定性，采用峰面積和外標(biāo)法對(duì)4種有機(jī)酸進(jìn)行定量計(jì)算。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用主成分分析法（principal component analysis，PCA）和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對(duì)獼猴桃果酒品質(zhì)進(jìn)行分析，采用Mann-Whitney 檢驗(yàn)對(duì)不同分組獼猴桃果酒各指標(biāo)的差異性進(jìn)行分析。采用PAST 3 軟件做PCA，其他分析均使用MATLAB 2016b 軟件；使用 Origin 2017 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃果酒滋味和風(fēng)味品質(zhì)評(píng)價(jià)

本研究首先使用電子舌技術(shù)對(duì)獼猴桃果酒8個(gè)滋味品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 獼猴桃果酒各滋味指標(biāo)的箱形圖（n=40）Fig.1 Box diagram of the taste indicators of kiwi fruit wine（n=40）

由圖1可知，納入研究的40個(gè)獼猴桃果酒在酸味和后味B（苦的回味）上具有較大的組間差異，極差值分別為5.05 和3.55，其次為苦味、咸味、豐度（鮮味的回味）和后味A（澀味的回味），極差值分別為2.69、2.22、1.63 和1.06，而在鮮味和澀味上的差異值較小，分別為0.99 和0.89。當(dāng)不同樣品在某一滋味指標(biāo)上的差值大于1.0 時(shí)，其差異可以通過(guò)感官鑒評(píng)的方法予以區(qū)分出[21]，由此可見(jiàn)，獼猴桃果酒的鮮味和澀味不會(huì)影響消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的喜好程度。

由圖1 亦可知，添加L.plantarum 發(fā)酵后部分獼猴桃果酒較之對(duì)照組其酸味、苦味、澀味、咸味和后味A（澀味的回味）呈明顯下降趨勢(shì)，而部分獼猴桃果酒的豐度（鮮味的回味）呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，添加L.plantarum可明顯改善獼猴桃果酒的滋味品質(zhì)，然而這與菌株自身的發(fā)酵特性有關(guān)，不同菌株之間差異較大，因而進(jìn)行獼猴桃果酒用優(yōu)良MLF 植物乳桿菌的篩選則顯得尤為重要。本研究進(jìn)一步采用電子鼻技術(shù)對(duì)不同處理獼猴桃果酒中典型物質(zhì)類(lèi)型進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

表1 獼猴桃果酒中風(fēng)味指標(biāo)的差異性分析（n=40）Table 1 Difference analysis of flavor indicators in kiwi fruit wine（n=40）

由表1可知，傳感器 W1C、W6S、W1S、W1W 和W3S 對(duì)添加L.plantarum 發(fā)酵獼猴桃果酒的響應(yīng)值明顯偏低，而傳感器W5S 和W5C 呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，添加L.plantarum可明顯提升獼猴桃果酒的香氣成分，同時(shí)對(duì)部分不良?xì)馕毒哂忻黠@的降低作用。

2.2 基于PCA獼猴桃果酒的差異性分析

以滋味和氣味為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在構(gòu)建18 行×40 列矩陣的基礎(chǔ)上，本研究使用PCA 對(duì)獼猴桃果酒品質(zhì)的區(qū)分度進(jìn)行了評(píng)價(jià)，PCA 的方差貢獻(xiàn)率如表2所示。

表2 主成分的方差貢獻(xiàn)率Table 2 Variance contribution rate of principal components

由表2可知，僅PC1 的特征值大于1，前5個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為87.89 %，分別為41.93 %、23.81%、13.27%、4.77%和4.11%。由此可知，18個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)降為了5個(gè)不相關(guān)的綜合變量，說(shuō)明了這5個(gè)綜合變量代表了絕大部分的變量信息，達(dá)到了降維的目的?；赑CA 獼猴桃果酒因子載荷圖如圖2所示。

圖2 基于PCA 獼猴桃果酒品質(zhì)的因子載荷圖Fig.2 Factor load map based on PCA kiwi fruit wine quality

由圖2可知，第一主成分（PC1）主要是由W3C、W2S、W1S、W2W、W1W 和 W3S 6個(gè)指標(biāo)構(gòu)成，PC1中載荷量較高的正影響品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)是W3S、W1S、W1W、W2W、W2S 和 W6S，其中 W3S 的載荷量最高為0.34，載荷量較高的負(fù)影響品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)是W3C，其載荷量為0.32，即PC1 的差異性主要集中在烷烴類(lèi)物質(zhì)和芳香類(lèi)物質(zhì)上；第二主成分主要是由W5C、澀味、W5S、后味A（澀味的回味）、酸味和W1C 構(gòu)成并占全部權(quán)重的23.81%，PC2中載荷量較高的正影響品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)是W5C、澀味、后味A（澀味的回味）和酸味，其中W5C 的載荷量最高為0.40，載荷量較高的負(fù)影響品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)為W1C，其載荷量為0.33，即PC2 的的差異性主要集中在澀味和芳香類(lèi)物質(zhì)上?；赑CA 分析獼猴桃果酒的因子得分圖如圖3所示。

圖3 基于PCA 獼猴桃果酒品質(zhì)的因子得分圖Fig.3 Factor score map based on PCA kiwi fruit wine quality

由圖3可知，40個(gè)獼猴桃果酒樣品在4個(gè)象限均有分布，其中分布于第一、二、三和四象限的樣品數(shù)分別為8、14、10個(gè)和8個(gè)。結(jié)合因子載荷圖可知，偏向X 軸正方向的獼猴桃果酒樣品在烷烴類(lèi)、甲烷類(lèi)、有機(jī)硫化物和乙醇的相對(duì)含量較高，偏向X 軸負(fù)方向的獼猴桃果酒樣品在芳香類(lèi)物質(zhì)含量較高；而偏向Y 軸正方向的獼猴桃果酒樣品在澀味、酸味、后味A（澀味的回味）和氫氧化物等強(qiáng)度較大，偏向Y 軸負(fù)方向的獼猴桃果酒樣品的芳香類(lèi)物質(zhì)含量較高。由此可知，位于第三象限的獼猴桃果酒品質(zhì)最好，其次為第二、第四和第一象限，因而第三象限的10 株菌株，尤其是7號(hào)（菌種資源庫(kù)中編號(hào)為 HBUAS52016）和8號(hào)L.plantarum（菌種資源庫(kù)中編號(hào)為HBUAS52017）可以作為獼猴桃果酒用優(yōu)良MLF 植物乳桿菌的潛在菌株進(jìn)行后續(xù)篩選。

2.3 獼猴桃果酒有機(jī)酸的分析

本研究以PCA 結(jié)果為分組依據(jù)，將40個(gè)獼猴桃果酒樣品分為 A、B、C組和 D組，同時(shí)結(jié)合 HPLC 對(duì)獼猴桃果酒中的4種有機(jī)酸進(jìn)行分析，從而對(duì)造成不同品質(zhì)獼猴桃果酒間差異的關(guān)鍵物質(zhì)進(jìn)行甄別，進(jìn)而為后續(xù)獼猴桃果酒用L.plantarum 的篩選提供指導(dǎo)。不同分組獼猴桃果酒中有機(jī)酸含量的比較分析結(jié)果如表3所示。

表3 獼猴桃果酒中4種有機(jī)酸的差異性分析Table 3 Difference analysis of four organic acids in kiwi fruit wine

由表3可知，獼猴桃果酒中奎尼酸的含量最高、其次是檸檬酸、乳酸和蘋(píng)果酸。經(jīng)Mann-Whitney 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C組獼猴桃果酒中奎尼酸和檸檬酸的含量顯著低于其他組（P〈0.05），而蘋(píng)果酸和乳酸的含量與其他組顯著均不差異（P〉0.05）。由此可見(jiàn)，品質(zhì)較佳的獼猴桃果酒其有機(jī)酸含量偏低，且添加L.plantarum可明顯降低獼猴桃果酒中的有機(jī)酸含量。

3 結(jié)論

以鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品菌種資源庫(kù)中39 株L.plantarum 為依托，將其與酵母菌混合發(fā)酵進(jìn)行獼猴桃果酒制備，并使用電子舌和電子鼻相結(jié)合的手段對(duì)獼猴桃果酒的品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分L.plantarum 通過(guò)降低獼猴桃果酒的酸味、苦味和澀味及提升香氣成分從而改善了獼猴桃果酒的品質(zhì)，且L.plantarum HBUAS52016 和L.plantarum HBUAS52017可作為獼猴桃果酒用優(yōu)良MLF 植物乳桿菌的潛在菌株進(jìn)行后續(xù)篩選。