微生物絮凝劑產生菌的鑒定及絮凝特性研究

武曉暢,鄭靖凡,李日強,曲睿娟,王小琴

(山西大學 環(huán)境與資源學院,山西 太原 030006)

目前,絮凝法在污水處理中應用非常廣泛[1],按其成分可分為有機絮凝劑、無機絮凝劑和生物絮凝劑。單獨使用無機絮凝劑時往往投藥量較大,致使運行費用較高,同時單獨使用無機絮凝劑時污泥量較大,處理不當極易成為二次污染。有機絮凝劑往往具有致突變、致癌、致畸作用并且屬于難生物降解物質。但是微生物絮凝劑具有高效、無毒、無二次污染、可生物降解等特點,屬于環(huán)境友好型材料引起了人們的關注[2-4]。

最早的絮凝劑產生菌是從活性污泥中篩選得到,目前絮凝劑產生菌的主要來源依然是從土壤、活性污泥中篩選獲得。細菌、放線菌、真菌及藻類等微生物都能產生微生物絮凝劑,但由于不同微生物分泌的絮凝劑性質不同,且微生物絮凝劑的成分復雜,目前為止人們對于微生物絮凝機理尚缺少一個較為清楚的解釋,在實際生產應用中往往造成不必要的浪費。對微生物絮凝機理假說大概分為:吸附架橋機理、電性中和機理、化學反應機理。

微生物絮凝劑的絮凝活性會受到絮凝體系條件的影響,已有大量的文獻對微生物絮凝劑的絮凝特性進行了研究[5-9]。本研究利用從土壤中分離出的兩株高效微生物絮凝劑產生菌PY-M3和PY-F6,研究了絮凝劑的添加量、高嶺土的濃度、水的pH值、助凝劑的種類、助凝劑的添加量、沉淀時間對絮凝效果的影響并對菌株進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用微生物絮凝劑產生菌株(PY-M3和PY-F6)為本實驗室從土壤中篩選獲得的;

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,KH2PO42 g,K2HPO45 g,(NH4)SO20.2 g,NaCl 0.1 g,脲0.5 g,酵母膏0.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0,112℃滅菌30 min;

助凝劑選用質量分數為1%的AlCl3、MgSO4、CuSO4、MnSO4、FeSO4、NaCl、KCl和CaCl2溶液。

1.2 微生物絮凝劑制備

在裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中分別接種從兩菌株斜面挑取的菌體,放入培養(yǎng)箱,120 r/min、30℃恒溫振蕩培養(yǎng)1 d,制得預發(fā)酵培養(yǎng)液。然后在裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中分別將制得的兩種預發(fā)酵培養(yǎng)液以2%的體積比接種,放入培養(yǎng)箱,120 r/min、30℃恒溫振蕩培養(yǎng)3 d,制得微生物絮凝劑備用。

1.3 微生物絮凝劑在絮凝處理高嶺土溶液時的影響因素

1.3.1 微生物絮凝劑添加量對絮凝效果的影響

取100 mL濃度為4 g/L的高嶺土懸濁液于200 mL的燒杯中,調節(jié)pH值為7,分別投加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 mL絮凝劑和5 mL質量濃度為1%的CaCl2溶液,待反應結束后靜置沉淀20 min,測定絮凝率,重復3次,取平均值。

1.3.2 pH值對絮凝效果的影響

取100 mL濃度為4 g/L的高嶺土懸濁液于200 mL的燒杯中,調節(jié)pH值分別為4、5、6、7、8、9、10、11,投加3 mL絮凝劑和5 mL質量濃度為1%的CaCl2溶液,待反應結束后靜置沉淀20 min,測定絮凝率,重復3次,取平均值。

1.3.3 高嶺土懸濁液濃度對絮凝效果的影響

分別取100 mL濃度為1、2、3、4、5、6、7、8 g/L的高嶺土懸濁液于200 mL燒杯中,調節(jié)pH值為8,投加3 mL絮凝劑和5 mL質量濃度為1%的CaCl2溶液,待反應結束后靜置沉淀20 min,測定絮凝率,重復3次,取平均值。

1.3.4 不同陽離子對絮凝效果的影響

取100 mL濃度為3 g/L的高嶺土懸濁液于200 mL燒杯中,調節(jié)pH值為8,分別投加3 mL絮凝劑和5.0 mL質量濃度為1%的不同助凝劑溶液,待反應結束后靜置沉淀20 min,測定絮凝率,重復3次,取平均值。

1.3.5 CaCl2投加量對絮凝效果的影響

取100 mL濃度為3 g/L的高嶺土懸濁液于200 mL燒杯中,調節(jié)pH值為8,分別投加 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL質量濃度為1%的CaCl2溶液和3 mL絮凝劑,待反應結束后靜置沉淀20 min,測定絮凝率,重復3次,取平均值。

1.3.6 沉淀時間對絮凝效果的影響

取100 mL濃度為3 g/L的高嶺土懸濁液于200 mL燒杯中,調節(jié)pH值為8,投加3 mL絮凝劑和質量濃度為1%的CaCl2溶液(PY-F6絮凝劑為2 mL,PY-M3絮凝劑為3 mL),待反應結束后靜置沉淀5、10、15、20、25、30、35、40 min,測定絮凝率,重復3次,取平均值。

1.4 菌株的鑒定

根據細菌通用引物序列設計PCR反應的引物,進行PCR擴增,PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,最后對PCR產物進行回收純化直接進行測序[10],將所測結果提交至GenBank并進行對比分析,對菌株進行鑒定。

1.5 測定項目與方法

絮凝率的測定[11]:在100 mL量筒中,分別加入80 mL蒸餾水,5 mL質量濃度為1%的CaCl2溶液和不同量微生物絮凝劑粗品,然后加水至100 mL。在200 mL燒杯中,稱取0.40 g高嶺土,將量筒中液體倒入燒杯中,調pH值至8.0左右,用攪拌器快速攪拌30 s(200 r/min),慢速攪拌5 min(50 r/min),靜置10 min后,用721型分光光度計測定上清液在波長為550 nm處的吸光度,同時以蒸餾水代替菌液和CaCl2作為對照,用下面的公式計算待測樣品的絮凝率:

絮凝率(%)=(A-B)/A×100%

(1)

式中：A:對照上清液在550 nm處的吸光度,B:樣品上清液在550 nm處的吸光度。

絮凝活性分布的測定[12]:將一定量發(fā)酵液在5 000 r/min離心30 min,取出菌體,用蒸餾水洗滌2次后置于與發(fā)酵液等體積的蒸餾水中,搖勻制成菌體細胞懸浮液。分別測定發(fā)酵原液(含細胞)、發(fā)酵上清液以及菌體細胞懸浮液的絮凝效率。

絮凝劑的熱穩(wěn)定性[13]:取50 mL的發(fā)酵液,在沸水浴中加熱5、10、15、20、25、30 min,通過測定發(fā)酵液在不同加熱時間下的絮凝效率來確定絮凝劑的熱穩(wěn)定性。

Fig.1 Effect of MBF dosage on flocculation efficiency圖1 微生物絮凝劑添加量對處理效果的影響

2 結果與討論

2.1 微生物絮凝劑添加量對絮凝效果的影響

絮凝劑的添加量直接影響絮凝效果,試驗分別考察了兩種微生物絮凝劑添加量對高嶺土懸濁液絮凝效果的影響，結果見圖1。

由圖1可知,兩種絮凝劑的絮凝率都是隨著添加量的增加而逐漸增大,PY-F6絮凝劑在添加量為30 mL/L時絮凝率達到最大97.84%。隨著添加量的繼續(xù)增加,絮凝率呈下降趨勢,但趨勢不明顯,PY-M3絮凝劑在投加量為30 mL/L時絮凝率達到最大92.72%。當投加量超過30 mL/L后絮凝率出現顯著下降,這可能是由于絮凝作用主要通過吸附架橋作用來絮凝水體中的膠體污染物,當加入過量微生物絮凝劑時,高分子物質將膠體粒子包裹起來,影響其脫穩(wěn)和凝聚,使得絮凝效果變差[14]。

2.2 水的pH值對絮凝效果的影響

試驗考察了兩種絮凝劑在不同pH條件下絮凝率的變化,結果見圖2。

Fig.2 Effect of pH on flocculation efficiency圖2 水的pH對處理效果的影響

由圖2可見, 在不同pH條件下,兩種絮凝劑的絮凝率變化較大,pH在4～7時兩種絮凝劑的絮凝效果較差。當pH為8時,絮凝效果最好,絮凝率分別為92.57%和95.95%。pH大于8絮凝率有緩慢下降的趨勢,但變化不明顯,說明本試驗中的兩種微生物絮凝劑在偏堿性條件下效果好。這可能因為pH影響表面電荷、帶電狀態(tài)以及中和電荷能力,在pH值較高的狀態(tài)下,膠體顆粒表面電荷降低,使得顆粒間排斥作用減弱,促進架橋形成和顆粒沉淀[15]。

2.3 高嶺土溶液濃度對絮凝效果的影響

改變高嶺土的濃度分別為 l、2、3、4、5、6、7和8 g/L,考察在不同懸濁液濃度下兩種絮凝劑的絮凝效果,結果見圖3。

Fig.3 Effect of concentration of Kaolin on flocculation efficiency圖3 高嶺土溶液濃度對處理效果的影響

由圖3可見,隨著高嶺土溶液濃度的增加,兩種絮凝劑的絮凝率都不斷上升,在高嶺土溶液的濃度為3 g/L時絮凝率達到最大,分別為92.32%和94.06%。當高嶺土溶液濃度繼續(xù)增加時,絮凝率都呈下降的趨勢。這可能是由于當高嶺土溶液濃度較低時,膠體物質較少,絮凝劑與膠體之間通過吸附架橋作用完成沉降,當高嶺土溶液濃度相對較高時,絮凝劑在溶液中的濃度相對降低,所能提供的結合位點較少,從而導致無法形成足夠的吸附架橋作用進行絮體團聚沉降[16]。

2.4 不同助凝劑對微生物絮凝劑絮凝效果的影響

選擇8種不同的陽離子作為助凝劑。通過對比單獨添加微生物絮凝劑的絮凝效果、單獨添加不同助凝劑的絮凝效果和兩者混合起來的絮凝效果,考察不同助凝劑對微生物絮凝劑絮凝效果的影響,見表1。

表1 不同助凝劑對微生物絮凝劑絮凝效果的影響

由表1可知,如果不添加助凝劑,兩種微生物絮凝劑的絮凝效果均不理想,PM-Y3絮凝劑絮凝效率僅為60%。加入Na+,K+后,絮凝效果受到抑制。加入Al3+、Mn2+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+后絮凝效果有一定的提升,Mn2+、Fe2+、Cu2+本身具有較好的絮凝作用,加入微生物絮凝劑中對絮凝效果的提升不明顯,而Al3+、Mg2+、Ca2+自身絮凝效果較差,但對微生物絮凝劑的助凝效果良好,且Ca2+對微生物絮凝劑的助凝效果最好。一般來說,金屬陽離子在絮凝劑中的作用主要是壓縮雙電層,二價陽離子可在絮凝劑分子與膠體顆粒間以離子鍵結合而促進絮凝發(fā)生;一價陽離子不能同時與膠體顆粒及絮凝劑鍵合,只能與其中之一結合而不利于絮凝作用的發(fā)生;三價陽離子可能由于離子強度過高,大量離子占據絮凝分子的活性位點,并把絮凝分子與膠體顆粒隔開而抑制絮凝[17]。

2.5 CaCl2投加量對絮凝效果的影響

在上述試驗基礎上選用助凝效果最好的CaCl2進行試驗,考察不同CaCl2投加量對絮凝效果的影響。結果如圖4。

Fig.4 Effect of CaCl2dosage on flocculation efficiency圖4 CaCl2投加量對絮凝效果的影響

由圖4可知,CaCl2投加量對于PY-M3和PY-F6兩種絮凝劑的絮凝效果都有明顯提升。當CaCl2投加量為10 mL/L時,Ca2+在體系中的濃度較低,對兩種絮凝劑絮凝效果的提升均不明顯。隨著CaCl2投加量的增加,絮凝效果均出現大幅度提升。當CaCl2投加量為20 mL/L時,PY-F6絮凝率達到94.8%。當CaCl2投加量為30 mL/L時,PY-M3的絮凝率達到92.9%,之后CaCl2投加量繼續(xù)增加時,絮凝效果逐漸下降,與之前的研究結果[18]相一致。

2.6 沉淀時間對絮凝效果的影響

對靜置沉淀時間在5-40 min時的絮凝效果進行測定,結果如圖5。

Fig.5 Effect of resting time on flocculation efficiency圖5 沉淀時間對絮凝效果的影響

由圖5可知,PY-F6絮凝劑在靜置20 min時絮凝率達到99%,且沉降速度非?？?。PY-M3絮凝劑的沉降過程相對較慢,靜置40 min時絮凝率達到96%。

2.7 絮凝活性分布及絮凝劑的收獲

測定微生物菌株的培養(yǎng)液、離心去除微生物細胞后的上清液和微生物細胞的菌懸液的絮凝率,結果見圖6。

Fig.6 Distribution of flocculation efficiency圖6 微生物菌株培養(yǎng)液絮凝活性分布

從圖6可知,PY-F6菌株上清液的絮凝率為96.7%,PY-M3菌株上清液的絮凝率為92.2%,可見兩種微生物絮凝劑的絮凝活性成分都主要分布在上清液中,說明發(fā)揮絮凝作用的主要成分是菌體細胞分泌的胞外代謝產物而非菌體本身。

將兩種菌株的發(fā)酵液離心30 min(5 000 r/min),取上清液與3倍體積的乙醇充分混合后在4℃下放置8 h,將形成的沉淀物離心30 min(5 000 r/min)收集,烘干稱重,PY-F6發(fā)酵液制得的絮凝劑粗品為1.51 g/L,PY-M3制得絮凝劑粗品為0.87 g/L。

2.8 微生物絮凝劑的熱穩(wěn)定性

測定在沸水浴中加熱不同時間后兩種微生物絮凝劑各自的絮凝率變化,考察其熱穩(wěn)定性并推斷起絮凝作用的活性成分的主要構成,結果見圖7。

Fig.7 Effect of heat-up time on flocculation efficiency圖7 不同加熱時間對絮凝效果的影響

由圖7可知,加熱5 min,兩種微生物絮凝劑的絮凝率都上升,PY-F6絮凝劑的絮凝率為96.22%,PY-M3絮凝劑的絮凝率為93.92%,從反應動力學的解釋可能是隨著溫度的上升,膠體粒子和懸浮物質的運動速度加快,從而促進懸浮顆粒與絮凝劑分子之間化學鍵的形成[19]。PY-F6絮凝劑的絮凝率隨加熱時間的增加而改變的幅度較小,熱穩(wěn)定性較好,其主要成分可能是多糖類,而PY-M3絮凝劑的絮凝率隨著加熱時間的增加出現明顯的下降,熱穩(wěn)定性較差,其主要成分可能是蛋白質或者核酸[20-21]。

2.9 菌株鑒定

菌株PY-F6在高氏1號平板上的生長狀態(tài)為圓形、邊緣整齊、中心淡紫色外圈白色、粉質狀、菌落較小,有氣味。

將擴增16srRNA基因片段的PCR產物利用試劑盒進行回收純化,之后將回收純化后的產物進行序列測定,測序結果為:

將該序列提交至GenBank進行比對,找出其最相似序列(表2)。

表2 GenBank中與絮凝菌PY-F6的16SrRNA基因最相似的序列

根據比對結果,PY-F6菌株可以鑒定為黃三素鏈霉菌(Streptomycesflavotricini)。

3 結論

(1)微生物絮凝劑在不同條件下對高嶺土溶液的絮凝研究表明,試驗所用菌株PY-F6和PY-M3產絮凝劑的最佳絮凝條件為,絮凝劑添加量為30 mL/L，pH為8，高嶺土溶液濃度為3 g/L，Ca2+的助凝效果最好，質量濃度為1%的CaCl2投加量為20 mL/L(PY-F6絮凝劑)和30 mL/L(PY-M3絮凝劑)，靜置沉淀時間為20 min(PY-F6絮凝劑)和40 min(PY-M3絮凝劑)。在最佳絮凝條件下,PY-F6絮凝劑的絮凝率達到99%,PY-M3絮凝劑的絮凝率達到96%。

(2)絮凝活性分布及絮凝劑的收獲研究表明,兩種微生物絮凝劑的絮凝活性成分都主要分布在上清液中,發(fā)揮絮凝作用的主要成分是菌體細胞分泌的胞外代謝產物而非菌體本身。PY-F6發(fā)酵液制得的絮凝劑粗品為1.51 g/L,PY-M3制得絮凝劑粗品為0.87 g/L。

(3)熱穩(wěn)定性研究表明,PY-M3絮凝劑的熱穩(wěn)定性較差,PY-F6絮凝劑的熱穩(wěn)定性較好。

(4) PY-F6菌株可以鑒定為黃三素鏈霉菌。