連翹葉與黃芩有效部位復(fù)配物對香腸保鮮研究

汪青波,田葉,田艷花,張立偉*

(1.山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,山西 太原 030006)

0 引言

肉制品在加工貯藏過程中,由于氧氣、微生物等作用,易發(fā)生腐敗和脂肪氧化,甚至?xí)a(chǎn)生有毒物質(zhì)[1]。出于保鮮和儲存需要,香腸中常加入抗氧化劑和防腐劑以延長其保質(zhì)期。常用的食品添加劑亞硝酸鹽對肉制品雖具有一定的防腐作用,但其易轉(zhuǎn)化生成對人體有害的強(qiáng)致癌物質(zhì)N-亞硝胺[2-3];同時,出于安全考慮,合成抗氧化劑(BHT、BHA)等在食品工業(yè)中的應(yīng)用也受到限制。目前,正在研究的天然抗氧化劑主要有茶葉提取物、中草藥提取物、果蔬提取物、香辛料提取物、維生素類物質(zhì)、含氮化合物等,其中茶葉提取物茶多酚在肉類產(chǎn)業(yè)中已得到廣泛應(yīng)用[4]。相對化學(xué)合成抗氧化劑和防腐劑,天然抗氧化劑和防腐劑的毒性要低很多[5-6]。因此,探索和開發(fā)低毒性及高效能的天然抗氧化劑、防腐劑依然是前沿研究的熱點(diǎn)方向,具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

連翹為木犀科植物連翹[(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl)]的干燥果實(shí)[7],傳統(tǒng)以果實(shí)入藥,連翹葉為其干燥葉,《中華本草》記載“連翹莖葉,味苦,性寒,主治心肺積熱”。連翹葉含有豐富的多酚類物質(zhì)[8],主要成分為連翹酯苷A、連翹苷等[9-10]。黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根[11],為我國傳統(tǒng)常用中藥,具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效。黃芩的主要化學(xué)成分為黃酮類[12],包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等。研究表明,連翹葉[13-16]和黃芩[17-18]都具有較強(qiáng)的抗氧化、抗菌活性。目前,關(guān)于連翹葉和黃芩提取物在此方面的報道較多,田葉[19]等研究了連翹葉清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺形成及抗氧化活性,結(jié)果表明,連翹葉水提取液經(jīng)D101大孔樹脂分離,40%乙醇(體積百分比，下同)洗脫部位總酚含量最高,具有較強(qiáng)的清除亞硝酸鹽和抗氧化能力,并能阻斷亞硝胺的形成;徐放等[20]采用中草藥結(jié)合涂膜保鮮技術(shù),比較了鹿蹄草、黃芩、半邊蓮、黃柏、北豆5種中藥提取液及復(fù)配制劑對草莓的保鮮作用,結(jié)果表明,黃芩提取液的保鮮效果僅次于鹿蹄草提取液,同時黃芩提取液對青霉、灰霉等霉菌的生長也有較強(qiáng)的抑制作用。然而,對于連翹葉及黃芩活性組分的復(fù)配在香腸保鮮防腐中的研究應(yīng)用卻鮮有報道。本課題組前期對黃芩清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺形成及抗氧化活性有效部位進(jìn)行了篩選,結(jié)果表明黃芩醇提取液經(jīng)D101大孔樹脂分離,60%乙醇洗脫部位總黃酮含量最高,黃芩素為其主要活性成分,且清除DPPH·、抑制亞硝胺形成及抗菌活性最強(qiáng),可作為天然抗氧化劑和防腐劑的來源;因此,本論文在前期研究基礎(chǔ)上選用連翹葉和黃芩抗氧化有效部位的復(fù)配物研究了對香腸抗氧化保鮮作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與試劑

連翹葉采摘于山西省陵川縣野生連翹基地,黃芩采挖于山西省陵川縣黃芩種植基地,經(jīng)本校分子科學(xué)研究所張立偉教授鑒定分別為木犀科植物連翹[(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl)]的干燥葉和唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根。

1,1,3,3-四乙氧基丙烷(體積百分比97%)、抗壞血酸鈉(麥克林 上海生化科技有限公司);NaCl(優(yōu)級純 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司);優(yōu)質(zhì)豬肉、五香粉、食鹽、味精、淀粉購于太原市華聯(lián)超市;實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水,其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司);先行者CP114萬分之一電子天平(美國奧豪斯 上海儀器有限公司);力可美LKM-JR08不銹鋼手搖式灌腸機(jī)(深圳市力可美科技有限公司);CARY 50紫外分光光度計(美國瓦里安公司);HH-ZK4二列圓孔水浴鍋(鞏義市予華有限責(zé)任公司);pH計(FZ-600復(fù)合電極)(成都世紀(jì)方舟科技有限公司);DZ500-2D真空包裝機(jī)(溫州市新泰包裝機(jī)械廠);SHK-99-Ⅱ臺式空氣恒溫?fù)u床(北方同正);高速冷凍離心機(jī)(金壇市水北科普實(shí)驗(yàn)儀器廠);FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)(金壇市友聯(lián)儀器研究所)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備及分析

精密稱取100 g連翹葉粉末(過40目篩),依次用料液比1∶10、1∶8的蒸餾水于100℃下回流提取2次,每次1 h[21],冷卻、過濾,合并2次濾液于60℃下減壓濃縮,冷凍干燥,得連翹葉粗提物。將預(yù)處理好的D101大孔樹脂濕法裝柱,精密稱取粗提物10 g,用水溶解、過濾、上樣。依次用20%、40%、60%、80%乙醇洗脫,得4個樣品組分。經(jīng)HPLC分析[22],將主要活性成分為連翹酯苷A[19]的40%乙醇洗脫液減壓濃縮,冷凍干燥,得連翹葉提取物(Fr)。

精密稱取100 g黃芩粉末(過40目篩),用料液比1∶35的53%乙醇70℃下回流提取2 h[23],冷卻、過濾,濾液于60℃下減壓濃縮,冷凍干燥,得黃芩粗提物。精密稱取黃芩粗提物10 g,用乙醇溶解后加入預(yù)處理好的D101大孔樹脂,依次用水、20%、40%、60%、80%乙醇洗脫,得5個樣品組分。經(jīng)HPLC分析[23],將主要活性成分為黃芩素[24]的60%乙醇洗脫液減壓濃縮,冷凍干燥,得黃芩提取物(S)。

1.3.2 樣品的復(fù)配

前期經(jīng)過對Fr和S配伍比例為3∶1，1∶1，1∶3的抗氧化、抑菌活性的初步篩選, Fr∶S=1∶3固定比的復(fù)配物活性最好; 另外就抑菌活性而言,Fr和S對金黃色葡萄球菌的抑制作用相當(dāng),但S對大腸桿菌的抑制作用顯著高于Fr,因此選用Fr∶S=1∶3進(jìn)行樣品對香腸保鮮作用的研究。

將1.3.1制備的樣品Fr和S,按1∶3的比例混合均勻,得復(fù)配樣品(FS)。

1.3.3 香腸制作

取肥瘦比例約3∶7的豬后腿肉,剔除淋巴、血管等結(jié)締組織,用絞肉機(jī)攪碎,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%亞硝酸鈉、0.15%味精、0.2%五香粉、2.5%食鹽、5%淀粉、10%冰水(均以肉重計),攪勻后分成5組:空白對照組(CT)、陽性對照組、添加0.25%、0.5%、1%復(fù)配物,分別標(biāo)記為T、V、FS1、FS2、FS3。其中,陽性對照組添加0.05%抗壞血酸鈉(Vc-Na)?？烧{(diào)高速勻漿機(jī)攪勻后于4℃下腌制48 h,真空包裝。沸水蒸40 min后冷卻,室溫(22℃)保存。在第0、1、2、3、4周取樣,進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測定。

1.3.4 香腸理化指標(biāo)的測定

1.3.4.1 pH值

參照GB/T 9695.5-2008進(jìn)行。取10 g香腸研碎后置于具塞錐形瓶中,加入90 mL蒸餾水,25℃恒溫?fù)u床上振搖30 min,過濾,測pH值。

1.3.4.2 過氧化值(POV)

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:采用比色法,參照GB/T 5009.37-2003進(jìn)行。以吸光度A為縱坐標(biāo),Fe2+的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得其線性回歸方程y=0.295c+0.000 8(R2=0.999 8),線性檢測范圍為0.2～4 μg/mL.

樣品測定:稱2 g香腸樣品,加入15 mL三氯甲烷∶甲醇=7∶3混合溶劑,13 000 r/min下均質(zhì)30 s,加入3 mL NaCl(0.5%)溶液,4℃下3 000 r/min離心10 min。取下層溶液5 mL到具塞比色管中,加入5 mL三氯甲烷∶甲醇=7∶3混合溶劑,加入50 μL FeCl2(3.5 g/L),搖勻后加入50 μL硫氰酸鉀(300 g/L),混勻,靜置5 min,于500 nm處測吸光度值。

1.3.4.3 硫代巴比妥酸值(TBA)

采用分光光度法,參照GB 5009.181-2016進(jìn)行。以吸光度A為縱坐標(biāo),丙二醛的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得其線性回歸方程y=0.779 8c+0.000 5(R2=1),線性檢測范圍為0.018～0.627 μg/mL.

1.3.4.4 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)

采用半微量定氮法,參照GB 5009.228-2016進(jìn)行。稱取10 g樣品置于250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL去離子水，搖勻，靜置30 min后過濾。取濾液10 mL于半微量凱氏定氮裝置的小玻管中，再加入5 mL氧化鎂混懸液(10 g/L)，同時向接受瓶內(nèi)加入10 mL硼酸溶液(20 g/L)和5滴混合指示劑(1 g/L甲基紅乙醇溶液與1 g/L的溴甲酚綠乙醇溶液按1∶5混合)蒸餾1 min。以0.01 mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到紫紅色。根據(jù)消耗鹽酸的量計算揮發(fā)性鹽基氮的含量(TVB-N)。

1.3.4.5 亞硝酸鹽的測定

采用分光光度法,參照GB 5009.33-2010進(jìn)行。以吸光度A為縱坐標(biāo),NaNO2濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程y=0.751 8c+0.003 1(R2=0.999 8),線性檢測范圍為0.02～0.22 μg/mL.

1.3.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值隨貯藏時間的變化

pH值是評價肉制品品質(zhì)的指標(biāo)之一,肉制品酸敗會導(dǎo)致pH值降低,嚴(yán)重影響肉制品品質(zhì)及保質(zhì)期。表1顯示了香腸pH值隨貯藏時間的變化,空白對照組、Vc-Na組、樣品組pH值都隨貯存時間延長而逐漸下降。其中,pH值在第0～1周下降較快,具有顯著性差異(P<0.05),這可能是由于香腸中蛋白質(zhì)分解為氨基酸或碳水化合物分解成有機(jī)酸導(dǎo)致[25];在第2～4周,各組pH值下降速度減緩,可能是隨貯藏時間延長,蛋白質(zhì)分解酶活性增強(qiáng),蛋白質(zhì)被分解為氨或堿性胺類物質(zhì)。相比空白組,樣品組pH值下降速度較慢,表明FS樣品具有延緩香腸酸敗的作用;同時,較高的pH環(huán)境可抑制香腸中致癌物質(zhì)亞硝胺的形成[26],保障了香腸的質(zhì)量安全。另外,在同周期下,樣品組pH值為FS3>FS2>FS1,表明FS對香腸酸敗的抑制作用與劑量呈正相關(guān)。本研究表明,FS樣品能有效延緩香腸中蛋白質(zhì)及碳水化合物的分解酸化,對香腸具有較好的保鮮作用。

表1 pH值的變化

2.2 POV值隨貯藏時間的變化

氫過氧化物是不飽和脂肪酸氧化的初級產(chǎn)物[27],POV值越大,脂肪氧化程度越高,生成的氫過氧化物越多。氫過氧化物不穩(wěn)定,易進(jìn)一步降解成醛、酮和酸等物質(zhì)[28],從而影響香腸品質(zhì)。

表2顯示,空白對照組、Vc-Na組和樣品組POV值都隨貯藏時間延長而升高;其中,第0～1周氧化速度緩慢,各組POV值無顯著差異(P>0.05);第2～4周,各組POV值顯著升高,原因可能是:脂肪氧化反應(yīng)是自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),包括引發(fā)、傳遞和終止三個階段,第1周屬于引發(fā)階段,氧化速度相對緩慢,第2周進(jìn)入傳遞階段,脂肪氧化速度迅速加快。分析發(fā)現(xiàn),從第3周開始,樣品組和Vc-Na組POV值較空白組顯著降低;在第4周,樣品中、高劑量組POV值還顯著低于Vc-Na組(P<0.05),這說明復(fù)配樣品和Vc-Na都能顯著抑制脂肪的氧化,同比下,樣品中、高劑量組抑制作用強(qiáng)于Vc-Na。比較樣品組POV值差異可知,樣品對脂肪氧化的抑制作用與劑量呈正相關(guān)。

表2 POV值的變化(單位:meq/kg)

2.3 TBARS值隨貯藏時間的變化

TBARS用于測定肉制品中丙二醛含量,是評價肉制品中脂肪氧化程度的另一種方法。與POV類似,其值越大,脂肪氧化程度越高。脂肪氧化會導(dǎo)致肉制品脂肪酸和脂溶性維生素嚴(yán)重?fù)p失,是肉制品貯藏過程中品質(zhì)惡化的一個主要原因。

從表3可知,隨貯藏時間延長,各組TBARS值升高,說明脂肪氧化程度隨貯藏時間增加而增強(qiáng)。在第0～1周,各組TBARS值上升較慢,此階段可能為脂肪初級氧化產(chǎn)物生成階段。在1～3周,各組(FS3除外)TBARS值上升較快,此階段可能是由于過氧化物積累,分解速度加快導(dǎo)致。比較第4周TBARS值可知,Vc-Na組和樣品組TBARS值均顯著小于空白組(P<0.05),且樣品組劑量越大,TBARS值越小,表明Vc-Na及復(fù)配樣品均可抑制香腸中脂肪氧化次級產(chǎn)物的形成,且復(fù)配樣品對脂肪氧化的抑制與劑量呈正相關(guān)。在第3～4周,樣品中、高劑量組TBARS值均顯著小于Vc-Na組(P<0.05),說明隨貯藏時間的延長,樣品中、高劑量組對脂肪氧化次級產(chǎn)物形成的抑制作用強(qiáng)于Vc-Na組。

表3 TBARS值的變化(單位:mg/kg)

2.4 TVB-N值隨貯藏時間的變化

TVB-N是指在內(nèi)源酶和細(xì)菌作用下,肉制品中的蛋白質(zhì)被分解成的揮發(fā)性氨及胺類(二甲胺、三甲胺)等含氮堿性物質(zhì),一定量生物胺對人體具有重要的生理功能[29],但含量過高則會起毒害作用[30]。TVB-N含量與肉制品腐敗程度具有一定相關(guān)性,是衡量肉制品腐敗變質(zhì)的重要指標(biāo)之一。

從表4可知,隨貯藏時間的延長,各組TVB-N值逐漸增大。與空白組相比,Vc-Na組在第1周有顯著性差異(P<0.05),2～4周差異不明顯(P>0.05),表明Vc-Na在第1周延緩了香腸中蛋白質(zhì)的腐敗,但由于Vc-Na不穩(wěn)定,隨著時間延長逐漸失活,故在2～4周TVB-N值快速增大,這也反映了Vc-Na抑菌作用不明顯。在1～4周樣品組與空白組的TVB-N值差異顯著(P<0.05),說明樣品有效抑制了香腸中蛋白質(zhì)的分解;比較樣品組間TVB-N值的差異可知,樣品對蛋白質(zhì)分解的抑制能力與劑量呈正相關(guān)。第4周時,樣品中、高劑量組的TVB-N值均顯著小于Vc-Na組(P<0.05),說明樣品中、高劑量組對抑制蛋白質(zhì)分解的能力強(qiáng)于Vc-Na組。

表4 TVB-N值的變化(單位:mg/kg)

2.5 亞硝酸鹽含量隨貯藏時間的變化

亞硝酸鹽作為肉制品添加劑歷史悠久,但它的安全性一直受國內(nèi)外廣泛關(guān)注。在酸性條件下它會分解成亞硝酸,亞硝酸又易分解成亞硝基,而亞硝基能與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物仲胺類物質(zhì)反應(yīng)生成亞硝胺[31]。亞硝胺具有致癌作用,所以亞硝酸鹽含量是評價香腸品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。

從表5可知,隨著貯存時間延長,各組亞硝酸鹽含量逐漸降低,值得注意的是:在0周,Vc-Na組、樣品組中的亞硝酸鹽含量顯著低于空白組(P<0.05),說明Vc-Na、樣品均可減少香腸中的亞硝酸鹽含量,且樣品對亞硝酸鹽的清除作用呈劑量依賴關(guān)系。在貯藏期間樣品中、高劑量組亞硝酸鹽的含量顯著低于Vc-Na組(P<0.05),可知樣品中、高劑量組對亞硝酸鹽的清除作用強(qiáng)于Vc-Na組。同時Vc-Na組和復(fù)配樣品組中亞硝酸鹽含量的減少,也有利于抑制香腸中亞硝胺的形成。

表5 亞硝酸鹽含量的變化(單位:mg/kg)

3 結(jié)論

本文通過對香腸各項(xiàng)理化指標(biāo)pH值、POV值、TBA值、TVB-N值和亞硝酸鹽含量的測定來評價連翹葉及黃芩提取物經(jīng)分離后抗氧化有效部位的復(fù)配對香腸的抗氧化保鮮作用。研究表明,不同劑量(0.25%、0.5%、1%)Fr與S復(fù)配樣品能有效抑制香腸各理化指標(biāo)含量的增加,且保鮮程度與劑量呈正相關(guān),同比下,樣品中、高劑量組作用強(qiáng)于陽性對照Vc-Na組,對香腸具有較好的防腐作用,從而延長香腸的保質(zhì)期。因此,本研究為探索和開發(fā)高效、安全的天然抗氧化劑具有重要指導(dǎo)意義,同時對連翹資源的深度開發(fā)利用提供了理論支持。