番石榴葉總黃酮對2型糖尿病模型小鼠肝糖異生ERRγ/CREBH信號通路相關(guān)因子的影響Δ

王宏，傅予，王蕾，江茜，劉洪斌

（天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020）

番石榴葉為桃金娘科植物番石榴（Psidium guajavaL.）的葉，具有生津止渴、甘平養(yǎng)胃、澀斂固陰的功效[1］。據(jù)文獻(xiàn)報道，番石榴葉提取物具有降糖的作用[2-3］。本課題組前期研究結(jié)果顯示，番石榴葉總黃酮（GLTF）的降糖機制與抑制肝糖異生有關(guān)[4］。雌激素相關(guān)受體（ERRs）因與雌激素受體在DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域上具有68%的同源性而得名，包括ERRα、ERRβ、ERRγ等3種亞型[5］。研究證明，ERRγ是肝糖異生過程的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子[6-7］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC1α）是一種核受體輔助激活因子，其作為ERRγ的共激活因子，能調(diào)控多條代謝途徑中基因的表達(dá)；在空腹?fàn)顟B(tài)下，PGC1α在肝臟中的表達(dá)明顯增多且在糖異生過程中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用[8］。環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白H（CREBH）是一種肝臟特有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)肝糖異生方面起著重要作用[9-10］。CREB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄輔激活因子2（TORC2）作為CREB的輔激活因子，其去磷酸化入核是激活CREB的基礎(chǔ)[11］。鑒于ERRγ和CREBH對肝糖異生的重要調(diào)控作用[6-7，10］，本研究利用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合多次腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）的方法復(fù)制2型糖尿?。═2DM）小鼠模型，并通過考察GLTF對小鼠肝臟中ERRγ/CREBH信號通路中上述相關(guān)因子表達(dá)的影響來探討其降糖作用的具體機制，旨在為其應(yīng)用于臨床降血糖治療提供更科學(xué)的依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

悅準(zhǔn)Ⅰ型710血糖儀（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；GFM-96M γ型放射免疫計數(shù)器（合肥眾誠機電技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司）；Ci-L型光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；TS-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床、QL-902型渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造公司）；5418R型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；Mini-PROTEAN Tetra型電泳儀、DYCZ-20C型垂直電泳槽、DYCP-40C型轉(zhuǎn)移槽（北京六一儀器廠）；7500型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）；ME203E型電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；VILBER Fusion FX7型成像系統(tǒng)（法國Vilber Lourmat公司）。

1.2 藥品與試劑

GLTF浸膏[由天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所制劑中心制備，每3.5 kg原藥材制得700 g浸膏[12］；所用番石榴葉（天津市三潭醫(yī)院提供，批號:13220042）經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院馬琳教授鑒定為桃金娘科番石榴屬植物番石榴（P.guajavaL.）的干燥葉］；鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號:AAL7649，規(guī)格:0.5 g/片）；消渴降糖膠囊（洛陽天生藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號:160902，規(guī)格:0.3 g/粒）；STZ試劑（美國Sigma-Aldrich公司，批號:S0130，規(guī)格:500 mg）；胰島素定量檢測試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）；兔ERRγ多克隆抗體、兔CREBH多克隆抗體、鼠磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；超純RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時PCR試劑盒、5×RNA Loading buffer（日本Takara公司）；其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為超純水。

1.3 引物

PGC1α、TORC2和GAPDH引物均由天津宏升爾特生物科技有限公司設(shè)計、合成，其序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.4 動物

SPF級健康雄性ICR小鼠90只，體質(zhì)量為16～18 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK（京）2016-0006。小鼠按6只/籠飼養(yǎng)于溫度20～25℃、濕度40%～70%的屏障環(huán)境中。所用基礎(chǔ)飼料和高糖高脂飼料均購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，其中高糖高脂飼料為基礎(chǔ)飼料加20%蔗糖、15%豬油、2%膽固醇和0.3%膽鹽。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

所有小鼠給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機選取12只小鼠為正常組，其余小鼠納入造模組。正常組小鼠繼續(xù)給予基礎(chǔ)飼料；造模組小鼠改用高糖高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)4周，然后禁食不禁水24 h，腹腔注射STZ溶液（100 mg/kg，以檸檬酸緩沖液為溶劑配制）qd，共注射2～3次。期間小鼠斷尾取血檢測血糖水平，以空腹血糖＞11.1 mmol/L視為T2DM模型成功建立[13］，停止注射。

取造模成功、狀態(tài)良好的小鼠60只，按空腹血糖值隨機分為模型組、二甲雙胍組（即Met組，0.17 g/kg；劑量根據(jù)臨床人用劑量以體表面積法換算而得）、消渴降糖膠囊組（即XKJT組，0.75 g/kg；劑量換算方法同Met組）和GLTF低、高劑量組（即GLTF-L組、GLTF-H組，劑量分別為0.047、0.094 g/kg，以浸膏質(zhì)量計；劑量根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果設(shè)定），每組12只。各組藥物溶液均以水為溶劑配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，用前搖勻。除正常組和模型組小鼠灌胃等體積水外，其余各組小鼠均灌胃相應(yīng)藥物溶液，給藥體積均為10 mL/kg，qd，連續(xù)21 d。給藥期間除正常組外，其余小鼠繼續(xù)給予高糖高脂飼料。

2.2 小鼠空腹血糖和胰島素水平檢測

末次給藥后第2天，各組小鼠于禁食不禁水5 h后，斷尾取血檢測空腹血糖水平；然后摘取其眼球取血，采用放射免疫法檢測空腹血清胰島素水平，并按公式計算胰島素敏感指數(shù)（ISI）:ISI＝lg[1/（空腹血糖×空腹血清胰島素水平）］。

2.3 小鼠肝和胰腺組織的病理學(xué)檢查

小鼠取眼球后處死，剖取其胰腺和一葉肝臟組織，置于10%甲醛溶液中固定48 h以上，脫水，石蠟包埋，切片（厚度為4 μm），然后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察兩者組織病理學(xué)變化。

2.4 小鼠肝組織中ERRγ、CREBH蛋白表達(dá)水平檢測

采用免疫印跡法進(jìn)行檢測。正常組、模型組和GLTF各劑量組各取6只小鼠的部分肝組織切成小塊，加入蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，以考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。所得蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分離后，以半干法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入ERRγ抗體（1∶500）、CREBH抗體（1∶500）、內(nèi)參GAPDH抗體（1∶1 000），于4℃搖床孵育過夜；次日用1×TBST洗膜10 min×3次，然后加入二抗（1∶3 000），于室溫下避光搖床孵育60 min；1×TBST洗膜10 min×3次后，曝光及洗片。采用成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測，采用Image J 1.42q軟件分析灰度值，以ERRγ、CREBH蛋白條帶與GAPDH條帶的灰度值之比以表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.5 小鼠肝組織中PGC1α和TORC2 mRNA表達(dá)水平檢測

采用實時定量PCR法進(jìn)行檢測。正常組、模型組和GLTF各劑量組各取6只小鼠的部分肝組織，采用超純RNA提取試劑提取總RNA，并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制得cDNA。采用熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系:Mix 12.5 μL，上、下游引物終濃度均為10 μmol/L，cDNA 2 μL，用ddH2O補足至20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃變性30 s；95℃退火30 s，60℃延伸34 s，共40個循環(huán)。采用2－ΔΔCt法[14］，以GAPDH為內(nèi)參，檢測各組小鼠PGC1α、TORC2的mRNA表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠的空腹血糖、血清胰島素水平及ISI值

與正常組比較，模型組小鼠的空腹血糖、血清胰島素水平均顯著升高，ISI值顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠的空腹血糖和血清胰島素水平均顯著降低，ISI均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。各組小鼠的空腹血糖、血清胰島素水平及ISI值見表2。

表2 各組小鼠的空腹血糖、血清胰島素水平及ISI值（x±s，n＝12）Tab 2 Fasting glucose，serum insulin and ISI value of mice in each group（x±s，n＝12）

3.2 各組小鼠肝臟和胰腺組織病理學(xué)變化

3.2.1 肝組織 正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞未見變性或壞死，匯管區(qū)血管及膽管未見異常，間質(zhì)未見結(jié)締組織增生，肝中央小靜脈、肝小動/靜脈及膽管系統(tǒng)均未見明顯變化；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)輪廓不清，肝細(xì)胞重度腫脹、增大并呈濁狀改變，可見大量空泡；各給藥組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞腫脹及空白變性程度均較模型組有所減輕，其中GLTF-H組改善效果較為明顯。各組小鼠肝組織病理學(xué)顯微圖見圖1。3.2.2 胰腺組織 正常組小鼠胰腺各小葉胰島細(xì)胞未見明顯變化；模型組小鼠胰島數(shù)目減少、體積變小，胰島細(xì)胞呈輕度空泡病變；各給藥組小鼠胰腺胰島數(shù)較模型組均有所增加，體積均有所增大。各組小鼠胰腺組織病理學(xué)顯微圖見圖2。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)顯微圖（HE染色，×100）Fig 1 Pathological micrographs of liver tissue of mice in each group（HE staining，×100）

圖2 各組小鼠胰腺組織病理學(xué)顯微圖（HE染色，×100）Fig 2 Pathological micrographs of pancreatic tissue of mice in each group（HE staining，×100）

3.3 各組小鼠肝組織中ERRγ和CREBH的蛋白表達(dá)水平

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中ERRγ、CREBH的蛋白表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，GLTF各劑量組小鼠肝組織中ERRγ、CREBH的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。各組小鼠肝組織中ERRγ、CREBH的蛋白電泳圖見圖3，蛋白表達(dá)水平見圖4。

圖3 各組小鼠肝組織中ERRγ和CREBH蛋白電泳圖Fig 3 Electrophoregrams of ERRγ and CREBH protein in liver tissue of mice in each group

3.4 各組小鼠肝組織中PGC1α、TORC2的mRNA表達(dá)水平

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中PGC1α、TORC2的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，GLTF各劑量組小鼠肝組織中PGC1α、TORC2的mRNA水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。各組小鼠PGC1α、TORC2的mRNA表達(dá)水平見圖5。

圖4 各組小鼠肝組織中ERRγ和CREBH的蛋白表達(dá)水平（x±s，n＝6）Fig 4 Protein expression levels of ERRγ and CREBH in liver tissue of mice in each group（x±s，n＝6）

圖5 各組小鼠肝組織中PGC1α和TORC2的mRNA表達(dá)水平（x±s，n＝6）Fig 5 mRNA expression levels of PGC1α and TORC2 in liver tissue of mice in each group（x±s，n＝6）

4 討論

T2DM患者占糖尿病總發(fā)病人數(shù)的95%以上，且易發(fā)生心腦血管疾病等嚴(yán)重并發(fā)癥[15-16］。因此，有效控制T2DM患者的血糖水平具有重要意義。肝糖異生異常導(dǎo)致的葡萄糖生成及輸出增多是糖尿病發(fā)病的重要病理因素。有效抑制肝臟過度糖異生，探求肝臟糖異生的分子機制以及尋找抑制肝臟過度糖異生的有效靶點，將成為治療糖尿病的重要途徑[17］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GLTF能顯著降低肝糖異生限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）的mRNA表達(dá)水平[4］，提示其降糖作用與抑制肝糖異生有關(guān)。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，探討了GLTF通過ERRγ/CREBH信號通路調(diào)控肝糖異生的具體機制。

二甲雙胍是臨床用于治療T2DM的經(jīng)典藥物，降糖效果顯著，且其降糖機制與抑制肝臟糖異生有關(guān)[18-19］；消渴降糖膠囊是以番石榴葉為主要成分之一的中成藥，臨床上降糖效果明確[20］，與GLTF有一定同源性。因此本研究選擇這兩種藥品作為陽性對照藥。

當(dāng)機體發(fā)生糖尿病時，肝細(xì)胞處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，ERRγ被激活，并在共激活因子PGC1α的參與下，通過雌激素受體反應(yīng)元件結(jié)合到CREBH啟動子上[21］，CREBH再通過TORC2依賴模式被激活[22］，最終調(diào)控肝糖異生的兩個限速酶——PEPCK和G-6-Pase[9］——進(jìn)而決定肝糖異生的速度和量。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠空腹血糖和胰島素水平均顯著升高，ISI值顯著降低；肝組織病變明顯、可見大量空泡；胰島數(shù)目減少、體積變小，胰島細(xì)胞呈輕度空泡病變。與模型組比較，GLTF各劑量組小鼠上述指標(biāo)和病理學(xué)變化均明顯改善，表明GLTF能顯著改善T2DM模型小鼠的血糖、胰島素水平，對肝細(xì)胞和胰島細(xì)胞均有一定保護(hù)作用。免疫印跡法和實時定量PCR法檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型小鼠肝組織中ERRγ、CREBH的蛋白表達(dá)水平及PGC1α、TORC2的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，提示T2DM模型小鼠肝臟ERRγ/CREBH信號通路被激活。與模型組比較，GLTF各劑量組小鼠肝組織中上述因子的蛋白或mRNA表達(dá)水平均顯著降低，提示GLTF可能通過抑制ERRγ/CREBH信號通路來抑制肝臟糖異生，從而發(fā)揮降糖作用。

綜上所述，GLTF能降低T2DM模型小鼠的空腹血糖及胰島素水平、提高ISI值，并能減輕肝組織病變程度，恢復(fù)胰腺組織中胰島數(shù)目和體積；能下調(diào)肝組織中ERRγ、CREBH的蛋白表達(dá)及PGC1α、TORC2的mRNA表達(dá)。這提示GLTF對T2DM模型小鼠的降糖作用機制可能與抑制肝臟ERRγ/CREBH信號通路有關(guān)。