豬圓環(huán)病毒2型抗體間接ELISA檢測方法的建立

徐保娟，王麗萍，崔曉霞，宮 曉，孫厚民，郭偉偉，李陸梅，范根成，榮 俊

（1.青島易邦生物工程有限公司，青島 266114；2. 動物基因工程疫苗國家重點實驗室，青島 266114；3. 長江大學(xué)，荊州 434000）

豬圓環(huán)病毒2型是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征等相關(guān)疾病的主要病原，對豬養(yǎng)殖業(yè)具有巨大危害，嚴重阻礙了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，PCV2感染現(xiàn)已成為危害我國規(guī)模化豬場養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要免疫抑制性疫病之一[1]。通常情況下，PCV2感染沒有明顯的季節(jié)性，在一年四季均可發(fā)生，PCV2感染率很高，但主要是隱性感染，豬群感染后不易被察覺，但易引發(fā)其他病原體的繼發(fā)侵染[2]。PCV2的衣殼蛋白（Cap蛋白）主要分布在宿主細胞核中，它有3個特異性抗原位點，這為建立特異性檢測PCV2的血清學(xué)方法奠定了基礎(chǔ)，其編碼產(chǎn)物也成為了檢測 PCV2感染的主要抗原[3-4]。本研究建立的豬圓環(huán)病毒2型間接ELISA抗體檢測方法具有良好的敏感性和特異性，可用于PCV2感染或疫苗免疫豬血清中和抗體的快速檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血清 豬圓環(huán)病毒2型標準陽性血清及陰性血清，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬細小病毒、豬胸膜肺炎、副豬嗜血桿菌、豬弓形蟲、豬衣原體陽性血清，40份采自豬免疫PCV2疫苗后35 d的血清（20份免疫的是青島易邦生物工程有限公司的PCV2基因工程亞單位疫苗、20份免疫的是江蘇勃林格殷格翰生物制品有限公司的豬圓環(huán)病毒2型桿狀病毒載體滅活疫苗），以上血清均由青島易邦生物工程有限公司技術(shù)中心實驗室制備；豬口蹄疫陽性血清購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；PCV2強陽性血清、弱陽性血清、陰性血清由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供；HRP-羊抗豬IgG購于美國BET HYL公司。

1.1.2 ELISA試驗相關(guān)試劑 PBS溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）、包被液（0.05 mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液）、洗液（0.01 mol/L pH 7.2磷酸鉀緩沖液）、封閉液（2%BSA 0.01 mol/L pH 7.2 PBS）、洗滌液（0.45 mol/L pH 7.2磷酸鉀緩沖液）、底物溶液A（pH 5.0檸檬酸醋酸緩沖液）、底物溶液B（0.01 mol/L pH 5.0 TMB-四甲基聯(lián)苯胺）和終止液（2 mol/L硫酸）由青島易邦生物工程有限公司技術(shù)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 ELISA試驗步驟 樣品稀釋：將按要求稀釋的血清樣品依次加入包被板中，37℃放置30 min；洗滌：加入洗滌液100 μL，棄洗滌液，每孔加300 μL蒸餾水，洗滌5次后，在吸水紙上拍干；溫育：向包被板中加入酶標結(jié)合物100 μL，37℃放置30 min；洗滌方法同前；顯色：加入底物溶液A和底物溶液B各100 μL，輕輕搖勻，37℃避光反應(yīng)10 min；終止：每孔加100 μL終止液終止反應(yīng)。

1.2.2 抗原最適包被濃度與血清稀釋度的確定 按方陣滴定法進行，用包被液將PCV2 Cap蛋白抗原稀釋成100、50、25、12.5、6.25 μg/mL，每孔100 μL，4℃過夜；陽性血清和陰性血清分別作1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600稀釋，每孔100 μL，每孔重復(fù)3次。進行ELISA試驗，測定各孔OD450，計算相同稀釋度的陽性血清和陰性血清孔之間的OD450的比值（P/N值），選擇P/N值最大孔的稀釋倍數(shù)作為抗原和血清的最佳稀釋濃度。

1.2.3 包被條件的確定 將包被板分別置于37℃ 2 h、4℃過夜和37℃2 h+4℃過夜3種條件下包被，對PCV2陰性、陽性血清進行ELISA試驗，每個樣品重復(fù)3次，測定各孔OD450，計算P/N值，選擇最佳包被條件。

1.2.4 封閉液的確定 分別用250 μL 2%BSA、 2%明膠、5%脫脂奶粉和1%卵清蛋白進行封閉，計算P/N值，選擇最佳封閉條件。

1.2.5 血清最佳結(jié)合時間的確定 ELISA試驗中，血清結(jié)合時間分別設(shè)定為15、30、45 min，每組設(shè)3個重復(fù)孔，測定各孔OD450，計算P/N值，選擇最佳血清結(jié)合時間。

1.2.6 二抗最佳稀釋度及結(jié)合時間的確定 ELISA試驗中，HRP-羊抗豬IgG稀釋度分別為1∶6000、1∶8000、1∶10 000、1∶12 000，每組設(shè)4個重復(fù)孔，于37℃分別溫育15、30、45 min測定各孔OD450，計算P/N值，選擇二抗最佳稀釋度及結(jié)合時間。

1.2.7 底物作用時間的確定 加入TMB，分別于37℃避光反應(yīng)5、10、15 min；按100 μL/孔加入終止液，測定OD450，計算P/N值，選擇底物最佳作用時間。

1.2.8 間接ELISA方法陰、陽性血清臨界值的確定 在選定的ELISA最佳反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，分別取3份標準陽性血清及3份陰性血清進行測定OD450。同時，檢測158份PCV2陰性豬血清的OD450，并設(shè)定陰、陽性血清對照。根據(jù)陰性標準血清和陽性標準血清的OD450，將158份陰性血清的平均值加5個標準差定位陰性血清的OD450臨界值，陰性血清的平均值加6個標準差定位陽性血清的OD450臨界值。計算相應(yīng)的S/P臨界值。S/P=（樣品OD450-標準陰性O(shè)D450）/（標準陽性O(shè)D450-標準陰性O(shè)D450）

1.2.9 間接ELISA方法的敏感性試驗 將PCV2陽性血清作1∶3200、1∶6400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200 5個稀釋度，分別用本研究建立的PCV2 ELISA抗體檢測方法及韓國JBT PCV2 ELISA抗體檢測方法進行檢測，記錄試驗結(jié)果。

1.2.10 間接ELISA方法的特異性試驗 分別將豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬口蹄疫病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬細小病毒、豬胸膜肺炎桿菌、副豬嗜血桿菌、豬弓形蟲、豬衣原體、豬圓環(huán)病毒特異性陽性血清及豬圓環(huán)病毒特異性陰性血清作1∶800倍稀釋后，用本研究建立的ELISA方法進行檢測，并設(shè)PCV2陰性、陽性血清對照，100 μL/孔加入酶標板，每份血清重復(fù)2孔，進行OD450測定，試驗重復(fù)3次。

1.2.11 間接ELISA方法的重復(fù)性試驗 用同一批純化的Cap蛋白制備的包被板和4批不同時間純化的Cap蛋白制備的包被板，分別取10份PCV2強陽性血清、弱陽性血清、陰性血清進行檢測，在其他條件不變的情況下，按照本研究建立的ELISA方法進行測定，每個樣品設(shè)4個重復(fù)，根據(jù)OD450進行統(tǒng)計學(xué)分析，分別判定批內(nèi)重復(fù)性和不同批次間的可重復(fù)性。

2 結(jié)果

2.1 最佳Cap蛋白包被濃度與血清稀釋度的確定 由表1結(jié)果可知，隨著Cap蛋白包被濃度的減少以及血清稀釋倍數(shù)的增大，血清的OD450不斷降低，當(dāng)Cap蛋白包被濃度在12.5～25 μg/mL，血清稀釋倍數(shù)為1∶800時，P/N值最大，但考慮到要保證足夠的包被蛋白，因此我們選擇25 μg/mL作為Cap蛋白最佳包被濃度，而血清最佳稀釋度為1∶800。

2.2 包被條件的確定 由表2可知，在4℃過夜的包被條件下，P/N值最大，P/N值為10.57。因此，選取4℃過夜作為最佳包被條件。

2.3 封閉液的確定 由表3可知，采用2%的BSA封閉的陰性值低，陽性值高，P/N平均值最大，據(jù)此，選用2%的BSA作為最佳封閉液。

表1 最適包被濃度與血清稀釋度的確定Table 1 Determination of optimal concentration and serum dilution

表2 最佳包被條件的確定Table 2 Determination of optimum package conditions

表3 最佳封閉液的確定Table 3 Determination of the best closed liquid

2.4 血清最適結(jié)合時間的確定 由表4可知，加入血清之后，在37 ℃作用30 min時P/N值最大，因此確定最佳反應(yīng)時間為30 min。

2.5 二抗最佳稀釋度及結(jié)合時間的確定 由表5可知，酶標記結(jié)合物作用時間30 min，稀釋度在1∶8000和1∶10 000時，P/N值均較高，考慮到酶標記結(jié)合物的保存期，最終確定二抗最佳稀釋度為1∶8000，最佳結(jié)合時間為30 min。

2.6 底物作用時間的確定 由表6可知，底物作用時間10 min時，P/N平均值最大。因此，我們選擇10 min作為最佳顯色時間。

2.7 間接ELISA方法陰、陽性血清臨界值的確定

2.7.1 陰性、陽性標準血清檢測結(jié)果 分別將3份PCV2陰性標準血清和3份PCV2陽性標準血清作1∶800倍稀釋后進行檢測，結(jié)果見表7。試驗結(jié)果表明，PCV2陰性血清的OD450值為0.061～0.089，均＜0.10，PCV2陽性血清的OD值為0.630～0.734，均≥0.60，陽性對照血清平行孔相差值分別為0.041、0.085和0.057，均≤0.30。因此，我們將研制的試劑盒中的陰、陽性對照血清的標準定為陽性對照血清OD450≥0.60，陰性對照血清OD450＜0.10。

2.7.2 158份陰性血清檢測結(jié)果 將158份陰性血清檢測結(jié)果用SPSS進行統(tǒng)計分析。本次試驗陰性血清平均OD450為0.085（表8），陽性對照OD450為0.651，陽性對照血清平行孔值相差≤0.3。檢測結(jié)果成立。

2.7.3 臨界值（OD450）的確定 按統(tǒng)計學(xué)正態(tài)分布的規(guī)律，99.993666%的面積在平均數(shù)加減4個標準差。為了降低假陽性，我們將陰性臨界值定為平均值加5個標準差，陽性的臨界值定為平均值加6個標準差。根據(jù)158份PCV2陰性血清的檢測結(jié)果（表9），陰、陽性血清判定標準：當(dāng)OD450≤0.200（陰性平均值+5×標準差）時判為陰性；當(dāng)OD450≥0.223（陰性平均值+6×標準差）時判為陽性；當(dāng)0.200＜OD450＜0.223時判為可疑。

表4 血清最適結(jié)合時間的確定Table 4 Determination of the optimal binding time of serum

表6 底物作用時間的確定Table 6 Determination of substrate action time

根據(jù)陰性標準血清OD450（0.085）和陽性標準血清的OD450（0.651），結(jié)合臨界值（OD450）的判定標準，計算S/P臨界值。在選定的ELISA最佳反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，檢測了3份PCV2標準陰性血清和3份PCV2標準陽性血清的OD450。通過S/P值的計算確定了臨界值判定標準：陽性對照血清OD450平均值應(yīng)≥0.60，且2份陽性對照血清OD450相差應(yīng)≤0.30；陰性對照血清OD450平均值應(yīng)＜0.10，實驗成立，否則無效。當(dāng)S/P≥0.25為陽性，0.20＜S/P＜0.25為可疑，S/P≤0.20為陰性。

表5 二抗最佳稀釋度及結(jié)合時間的確定Table 5 Determination of the best dilution and binding time of the second antibody

2.9 間接ELISA方法的敏感性試驗 由表10可見，本研究建立的ELISA檢測方法（自制試劑盒）檢測3份PCV2陽性血清的陽性滴度為1∶12 800～1∶25 600，高于韓國試劑盒的陽性檢出滴度1∶3200～1∶6400。說明本研究建立的ELISA檢測方法具有較高的靈敏性。

2.10 間接ELISA方法的特異性交叉試驗 由表11可見，對豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬口蹄疫病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬細小病毒、豬胸膜肺炎、副豬嗜血桿菌、豬弓形蟲、豬衣原體等10種其他病原體的20份陽性血清及2份PCV2陰性血清檢測結(jié)果均為陰性，2份PCV2陽性血清為陽性，表明本研究建立的ELISA檢測方法具有良好的特異性。

2.11 間接ELISA方法的重復(fù)性試驗

2.11.1 批內(nèi)重復(fù) 根據(jù)表12可以看出，批內(nèi)間重復(fù)性良好，C.V%值為2.26%～7.60%，均小于10%。

2.11.2 批間重復(fù) 根據(jù)表13可以看出，批間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均值（C.V%）為1.67%～6.41%，小于10%。表明不同批次純化的Cap抗原具有良好的穩(wěn)定性，證明本研究建立的ELISA方法批間重復(fù)性良好。

3 討論

表7 陰性、陽性標準血清檢測結(jié)果Table 7 Positive and negative serum test results

表8 158份PCV2陰性血清ELISA檢測OD450統(tǒng)計結(jié)果Table 8 158 PCV2 negative serum OD450 of ELISA detection results

表9 158份PCV2陰性血清ELISA檢測結(jié)果Table 9 The ELISA results of 158 PCV2 negative serum

表10 敏感性試驗比較結(jié)果Table 10 The results of the sensitivity tests

表11 特異性試驗結(jié)果Table 11 Results of specific tests

（續(xù)上表）

表12 批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果Table 12 Results of repeated trials in batches

表13 批間重復(fù)性試驗結(jié)果Table 13 Results of repeated trials between batches

（續(xù)上表）

目前，對豬圓環(huán)病毒2型抗體的檢測方法主要包括ELISA檢測法、免疫熒光檢測法、間接血凝試驗和放射免疫測定，其中ELISA檢測法和間接血凝試驗在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用較為廣泛。間接血凝作為抗體檢測的經(jīng)典方法在國內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用，但是該方法存在敏感性低、待檢血清需經(jīng)過滅活處理、增加了檢測的時間和檢測的難度、且肉眼判讀、誤差大等缺點，不適合規(guī)?；B(yǎng)殖場的大面積檢測。間接血凝作為抗體檢測的經(jīng)典方法在國內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用，但是該方法存在敏感性低、待檢血清需經(jīng)過滅活處理、增加了檢測的時間和檢測的難度、且肉眼判讀、誤差大等缺點，不適合規(guī)?；B(yǎng)殖場的大面積檢測。間接ELISA具有微量、敏感性高、特異性強、操作簡便、操作人員不需培訓(xùn)、樣品不需預(yù)處理、無需特殊儀器設(shè)備、特別適合于基層獸醫(yī)部門和規(guī)?；B(yǎng)殖場的快速診斷[5-6]在豬圓環(huán)病毒的抗體水平檢測上具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

間接ELISA的優(yōu)點使得其在生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，馬超英[7]通過對4種抗體檢測方法的比較，確定間接ELISA的特異性和敏感性均較高；黃立等[8]通過間接ELISA成功檢測出豫南地區(qū)的PCV2抗體水平；張琪等[9]成功建立山羊痘病毒抗體的間接ELISA抗體檢測方法；曹增國等[10]成功建立埃博拉病毒抗體的間接ELISA抗體檢測方法。ELISA抗體檢測方法由于具有敏感性高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，正在被廣泛應(yīng)用。

本研究通過條件不斷優(yōu)化，確定當(dāng)抗原包被濃度為25 μg/mL、封閉液為2%的BSA-PBS、血清1∶800稀釋且孵育時間為30 min、二抗為1∶8000稀釋且孵育時間為30 min、底物作用時間10 min時，P/N值最大。確定陰、陽性血清臨界值：當(dāng)S/P≥0.25為陽性血清；0.20＜S/P＜0.25為可疑血清；S/P≤0.20為陰性血清。同時，對其敏感性、特異性以及重復(fù)性進行了試驗，結(jié)果表明，我們成功建立了敏感性高、特異性強及重復(fù)性好的豬圓環(huán)病毒2型抗體間接ELISA檢測方法，為PCV2感染地區(qū)的血清流行病學(xué)調(diào)查及疫苗免疫評價提供了一種有效可靠的技術(shù)手段，為PCV2血清抗體檢測試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。