基于CUMS大鼠逍遙散拆方藥隊抗抑郁作用的BDNF通路分子機制研究

賀欣雨，王學，石博宇，羅杰，劉小波，彭希，曾南，劉蓉

逍遙散源于《太平惠民和劑局方》，具有調(diào)和肝脾、養(yǎng)血健脾、疏肝解郁之功效，是疏肝解郁的代表方劑[1]。實驗研究與臨床應用均證實逍遙散抗抑郁作用確切。課題組前期采用“功效拆方”研究模式將逍遙散拆分為疏肝藥(柴胡+薄荷)、養(yǎng)血藥(當歸+白芍)、疏肝藥+健脾藥(白術+茯苓+生姜+炙甘草)、養(yǎng)血藥+健脾藥藥隊組別，發(fā)現(xiàn)逍遙散疏肝藥隊、養(yǎng)血藥隊能明顯改善CUMS模型大鼠抑郁樣行為，認為柴胡、當歸、白芍及薄荷是逍遙散全方發(fā)揮抗抑郁作用的主要功效藥隊[2]；在“功效拆方”研究基礎上，通過小鼠FST、TST實驗進行4味藥物最佳配伍比例篩選，獲得由柴胡、當歸、薄荷3味藥物組成的精簡有效藥隊（逍遙散拆方藥隊），具有與全方相當?shù)目挂钟糇饔帽憩F(xiàn)[3]。本研究以慢性不可預知溫和應激（CUMS）大鼠模型為載體，基于前期藥效學的研究基礎，即該藥隊能有效改善CUMS大鼠的抑郁樣行為，明顯提高大鼠血清與腦組織中腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）水平，降低ACTH、Cort濃度[4]，著重采用分子生物學方法測定CUMS大鼠皮層、海馬部位BDNF通路相關分子的基因與蛋白表達水平，有效證實其抗抑郁作用發(fā)揮與干預BDNF通路的關系。

1 材料

1.1 實驗藥物

逍遙散全方與逍遙散拆方藥隊中當歸、白芍、茯苓、白術、生姜、薄荷、炙甘草購自成都太極大藥房；柴胡購自河北一仁藥業(yè)有限公司。各組藥物的制備方法與前期研究一致[4]。逍遙散全方藥液濃度為1.5 g生藥/mL，逍遙散拆方藥隊藥液濃度為0.765、0.575 g生藥/mL。實驗中逍遙散劑量沿用前期研究有效劑量30 g．kg-1（臨床劑量的30倍），逍遙散拆方藥隊依據(jù)前期研究中小鼠的有效劑量換算為大鼠的等效劑量，分別為15.33、11.5 g．kg-1。鹽酸阿米替林（amitriptyline hydrochloride，10 mg．kg-1），SIGMA公司，批號039K1600。

1.2 實驗動物

Wistar大鼠，SPF級，雄性，成都達碩生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（川）2015-030。

1.3 實驗主要儀器

ZHWY-100H恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；MDF-U50V超低溫冰箱，日本 Sanyo 公司；SYNS00000純水儀，Millipore公司；UPT-2-5T超純水儀，成都優(yōu)普電子產(chǎn)品有限公司； DYY-6C電泳儀電源，北京市六一儀器廠；GELDOCEQ凝膠成像分析儀、iCycler iOMulticolor Real-Time PCR Dectection System、垂直式電泳儀、濕轉轉膜儀、Bio-Rad 小型垂直電泳槽、轉膜槽、Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)、Image Lab凝膠分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.4 實驗主要試劑

DEPC，AMRESCO公司，批號0855C144。AxyPrepTMMultisoure Total RNA Miniprep Kit 50-prep Nucleic Acid Purification Kit，AxyGEN公司，批號03415KD1。FastQuant RT Kit 100rxn(With gDNase)、SuperReal PreMixPlus20 μL*500 rxn (SYBR Green)，TIANGEN公司，批號分別為P4318、 P4229。RIPA裂解液（強）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、蛋白上樣緩沖液（SDS-PAGE）5×，碧云天生物技術研究所，批號分別是P0013B、P0010S、P0015L。β-Tubulin Rabbit mAb、 TrkB Rabbit mAb、CREB Rabbit mAb、 pCREB Rabbit mAb、Anti-rabbit IgG HRP-Linked Antibody，Cell Signaling公司，批號分別為#2128、#4603、#9197、#9198、#7074。BDNF Rabbit mAb，abcam公司，批號ab108319。

2 實驗方法

2.1 造模、分組與給藥

取健康雄性Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)3天，按體重分層隨機分為6組：空白對照組及模型1-5組，模型組大鼠單只單籠飼養(yǎng)，并施加CUMS程序進行造模，空白對照組大鼠合籠飼養(yǎng)不施加造模程序。造模前及開始造模后每周測定大鼠糖水偏好率，造模4周后，通過比較模型組大鼠造模前后糖水偏好率的變化差異，且出現(xiàn)自主活動減少行為，以評價大鼠模型是否成功。第5周將篩選合格的模型1-5組大鼠重新分為CUMS模型對照組、阿米替林組（10 mg．kg-1）、逍遙散全方組（30 g．kg-1）、逍遙散拆方藥隊15.33、11.5 g．kg-1劑量組，各組動物開始分別灌胃給予相應藥物，給藥體積2 mL/100g，每日一次，連續(xù)4周，空白對照組與模型對照組大鼠給予等體積蒸餾水，給藥期間模型組和所有藥物組大鼠持續(xù)造模[4]。CUMS程序刺激因子參見文獻選擇[2]。

2.2 實時熒光定量PCR檢測CUMS大鼠海馬、皮層BDNF、TrkB、CREB mRNA表達水平

各組大鼠給藥4周后進行行為學測試，測試結束后處死大鼠，迅速剝離大鼠全腦，在冰上分離取得大腦海馬、皮層組織，-80℃保存?zhèn)溆谩７謩e稱取大鼠海馬和皮層組織20～30 mg，置于冰上解凍，采用AxyGEN總RNA小量制備試劑盒提取樣本總RNA，并檢測RNA的純度及含量，按照Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書進行逆轉錄獲得cDNA，運用RT-PCR法檢測BDNF、TrkB、CREB、GR mRNA的表達，各基因PCR反應程序如下：95 ℃ 15 min預變性；95℃ 10s變性及60.4℃（BDNF、TrkB）、62.4 ℃（β-actin、CREB）30s退火，39個循環(huán)；65℃ 5 s采集熒光，共60個循環(huán)，每循環(huán)溫度增加0.5℃至95℃。采用相對定量法，以β-actin基因為內(nèi)參基因，以樣本的平均Cq值作為校正值。依據(jù)公式F=2-△△Cq=2-(△1Cq-△2Cq)，通過差異值反映逍遙散拆方藥隊對大鼠海馬、皮層組織各指標mRNA表達的影響。所有引物由invitrogen(上海）公司設計合成，基因引物堿基序列見表1。

表1 基因引物序列

2.3Western Blot法檢測CUMS大鼠皮層、海馬BDNF、TrkB、CREB、pCREB蛋白表達水平

稱取40 mg左右的大鼠海馬或皮層組織，置于已滅菌烘干且用液氮預冷的的研缽中，加入液氮研成粉末狀，再加入 400 μL RIPA 裂解液研磨，充分研磨融解后將勻漿液轉移至1.5 mL EP管內(nèi)，渦旋混勻，冰上放置直至充分裂解。4℃10000 g 離心 5 min，取上清，立即 用BCA 法測定樣本總蛋白含量，將所有樣本蛋白濃度調(diào)至等濃度。按WB法常規(guī)操作制備電泳樣本，進行電泳后采用濕法轉膜，轉膜后的PVDF膜用封閉液封閉2 h，取出至新的封閉袋中，加入一抗（兔源Anti-β-Tubulin antibody、Anti-BDNF antibody、Anti-TrkB antibody、Anti-CREB antibody、Anti-pCREB antibody均按1:1000稀釋），封口，4℃冰箱靜置過夜。孵育后取出漂洗，再加入二抗（HRP-山羊抗兔IgG按 1：1000稀釋）孵育1.5 h。取出PVDF膜漂洗后，顯色液顯色，ChemiDocTM XRS+Imaging System 凝膠掃描成像儀中掃描成像，運用Imade lab圖像分析系統(tǒng)分析條帶光密度值，采用目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-Tubulin條帶光密度值的比值作為目的蛋白的蛋白相對表達量進行統(tǒng)計。

2. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗所得數(shù)據(jù)均以x±s表示，均用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），不符合正態(tài)分布者采用非參數(shù)秩和檢驗（Mann-Whitney U）分析。

3 實驗結果

3.1 CUMS大鼠海馬、皮層部位BDNF、TrkB、CREB mRNA的相對表達量

結果見表1、表2。與空白組比較，CUMS造模能顯著降低大鼠海馬、皮層BDNF、TrkB、CREB mRNA表達水平（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，逍遙散、逍遙散拆方藥隊11.5、15.33 g．kg-1劑量均明顯上調(diào)海馬部位BDNF、TrkB、CREB mRNA的表達水平（P＜0.05或P＜0.01）。逍遙散對皮層部位TrkB mRNA的表達有上調(diào)作用（P＜0.05）；逍遙散拆方藥隊15.33 g．kg-1劑量能顯著上調(diào)皮層部位BDNF、TrkB、CREB mRNA的表達水平（P＜0.01），逍遙散拆方藥隊11.5 g．kg-1劑量呈現(xiàn)一定上調(diào)趨勢（P＞0.05）。

表1 逍遙散拆方藥隊對CUMS大鼠海馬BDNF、TrkB、CREB mRNA水平的影響（x±s）

表2 逍遙散拆方藥隊對CUMS大鼠皮層BDNF、TrkB、CREB mRNA水平的影響（x±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3.2 CUMS大鼠海馬、皮層部位BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白表達水平

結果見表3、表4，圖1。與空白組相比，CUMS程序造模能抑制大鼠海馬、皮層部位BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白的表達，降低CREB磷酸化水平（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，在海馬部位，逍遙散、逍遙散拆方藥隊11.5、15.33 g．kg-1劑量均明顯促進BDNF、TrkB蛋白的表達（P＜0.05或P＜0.01）；逍遙散拆方藥隊11.5 g．kg-1劑量能提高CREB磷酸化水平（P＜0.01），逍遙散、逍遙散拆方藥隊15.33 g．kg-1劑量對CREB磷酸化有一定促進作用。在皮層部位，逍遙散明顯促進CREB的磷酸化（P＜0.01），對BDNF、TrkB蛋白的表達有提高趨勢；逍遙散拆方藥隊11.5 g．kg-1劑量明顯提高TrkB蛋白表達和CREB磷酸化水平（P＜0.05或P＜0.01），對BDNF蛋白表達的作用不明顯；逍遙散拆方藥隊15.33 g．kg-1劑量僅能顯著提高CREB的磷酸化水平（P＜0.05），一定程度上調(diào)BDNF、TrkB蛋白表達。

表3 逍遙散拆方藥隊對CUMS大鼠海馬BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白表達的影響（x±s）

表4 逍遙散拆方藥隊對CUMS大鼠皮層BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白表達的影響（x±s）

圖1 CUMS大鼠海馬、皮質(zhì)部位BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白表達圖譜

4 討論

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）是腦內(nèi)最豐富的一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，BDNF 對神經(jīng)元的生長、增殖、存活和突觸活動至關重要[5]，在大腦皮層、海馬、嗅 球、基底前腦、中腦、下丘腦各個區(qū)域均能檢測到 BDNF 蛋白和 mRNA的表達[6]。BDNF 可通過促進神經(jīng)突觸生長而建立神經(jīng)元和靶細胞之間的突觸聯(lián)系[7]，且能與其他主要神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)（包括谷氨酸能神經(jīng)系統(tǒng)、γ-氨基丁酸能神經(jīng)系統(tǒng)、血清素能神經(jīng)系統(tǒng)和多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)）相互作用而參與促進正常神經(jīng)系 統(tǒng)的發(fā)育[8～9]，研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥自殺患者的海馬和前額葉皮層部位的 BDNF 水 平降低，但在接受抗抑郁藥物治療的受試者中未觀察到類似的 BDNF 降低現(xiàn)象[10]。此外，CUMS應激程序可引起動物海馬和前額葉皮層 BDNF mRNA和蛋白 表達明顯減少，抗抑郁藥物的治療則可增加這些大腦區(qū)域的 BDNF水平[11]，目前認為 BDNF的減少是抑郁癥的發(fā)病機制之一。

BDNF 作為中樞神經(jīng)級聯(lián)信號傳遞的關鍵分子，與抑郁癥的發(fā)生密切相關，是抗抑郁藥物治療的重要靶位，其功能的表達需要酪氨酸蛋白激酶 B（TrkB）參與。TrkB是受體酪氨酸激酶 Trk 家族的一員，為 BDNF 的特異性高親和力受體，能介導BDNF下游通路[12]。文獻報道抑郁樣模型動物及抑郁癥患者海馬 BDNF 及其受體 TrkB 的水平明顯降低，該表現(xiàn)可被抗抑郁藥逆轉[9,13]。BDNF 與 TrkB 結合致TrkB 酪氨酸殘基的自磷酸化，隨后通過 Ras-MEKMAPKERK1/2 或 PI3K-Akt 信號級聯(lián)激活環(huán)磷腺苷反應元件結合蛋白（CREB），促進 CREB 磷酸化[14]。CREB是腦內(nèi)重要的核轉錄因子，調(diào)節(jié)基因的表達，參與許 多與神經(jīng)保護相關的過程，活化的 CREB 能夠調(diào)控多種與神經(jīng)細胞再生、存活 密切相關的活性物質(zhì)的轉錄水平，包括 BDNF。抑郁患者的尸檢發(fā)現(xiàn)，病人腦 內(nèi)不僅 BDNF 和其受體 TrkB mRNA 表達水平，而且 CREB、pERK1/2 和 ERK1/2 的 mRNA水平均明顯降低[15]，相反患者若經(jīng)過抗抑郁治療后上述基因表達水平有所提高[16]。抑郁癥動物模型的研究亦表明，模型大鼠海馬區(qū) BDNF 表達明顯下調(diào)，與 CREB 和 ERK1/2 的磷酸化水平降低有關[17]。

本實驗表明，與空白組相比，CUMS 大鼠海馬與皮層部位 BDNF、TrkB、 CREB mRNA 和蛋白表達水平，以及 CREB 磷酸化程度均下調(diào)，與該模型大鼠 前期研究發(fā)現(xiàn)的大鼠血清、海馬與皮層部位 BDNF 水平，以及血清 TrkB、 CREB 水平均明顯降低的結果相吻合[4]，且與已有的抑郁樣動物和臨床抑郁癥患者研究的文獻報道相符，進一步證實了 BDNF 在抑郁癥發(fā)病機制與治療中的重 要地位，同時也提示本研究中模型動物的成功建立。與模型組比較，逍遙散、 逍遙散拆方藥隊 11.5、15.33 g．kg-1劑量連續(xù)給藥 4 周，均可提高 CUMS 大鼠中樞 BDNF、TrkB、CREB mRNA 和蛋白表達水平，并促進 CREB 磷酸化，其中在海馬部位的上調(diào)作用相對優(yōu)于皮質(zhì)部位，逍遙散、逍遙散拆方藥隊作用表現(xiàn) 基本一致；其次該實驗結果與前期直接測定CUMS 大鼠血清與中樞部位 BDNF、 TrkB、CREB水平的結果吻合[4]，從分子水平上表明了逍遙散拆方藥隊及逍遙

散全方能通過上調(diào) BDNF-TrkB-CREB 通路發(fā)揮抗抑郁作用，且提示逍遙散精簡藥方即逍遙散拆方藥隊的作用機制與表現(xiàn)類似全方，具有較好的應用價值，同時再次證實了 BDNF是逍遙散及其拆方藥隊抗抑郁作用發(fā)揮的重要靶點，但究 其如何影響Ras-MEK-MAPK-ERK1/2 或 PI3K-Akt 信號通路來促進 CREB 的磷 酸化尚待進一步探討。