不同表型杉木NIPAs基因的表達(dá)分析

王 培， 張家君， 呂蒙蒙， 馬志慧， 陳 宇， 林思祖

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院；2.國(guó)家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心；3.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

鎂離子(Mg2＋)是細(xì)胞中第二豐富的陽(yáng)離子，對(duì)于生命活動(dòng)具有重要的作用.在植物中，Mg2＋參與多種生理反應(yīng)，比如維持細(xì)胞酶活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)陰陽(yáng)離子的平衡、參與核糖體的聚集、蛋白質(zhì)合成、葉綠體色素合成和光合作用等活動(dòng)[1-3].Mg2＋作為葉綠素分子的中心原子，在植物缺鎂時(shí)，最典型的癥狀就是葉片衰老和萎黃[4]，此時(shí)植物體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)淀粉和蔗糖等物質(zhì)的積累，同時(shí)光合作用減少CO2的固定，進(jìn)而產(chǎn)生活性氧，活性氧則進(jìn)一步損害葉綠素和葉綠體膜，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受阻[5-6].鎂的運(yùn)輸主要依賴(lài)于鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，目前已知的鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括CorA類(lèi)Mg2＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、P型ATP酶Mg2＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、MgtE類(lèi)Mg2＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Mg2＋/H＋交換體、Mg2＋通道轉(zhuǎn)運(yùn)體以及其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MagT和NIPA等)[7].在植物體內(nèi)，目前研究較深入的主要是CorA類(lèi)Mg2＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MGTs(MRS2s)和Mg2＋/H＋交換體MHX.有研究表明，在擬南芥中，At-MGT1 與 Mg2＋離子結(jié)合的親和力最高[8]；而 AtMHX 與 Mg2＋、Zn2＋和 Fe2＋等離子進(jìn)行質(zhì)子交換[9].NIPAs蛋白多在哺乳動(dòng)物中有研究，Goytain et al[10-11]研究表明，NIPA1是與痙攣相關(guān)的鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，NIPA2則與鎂代謝和腎臟保護(hù)有關(guān)，對(duì)Mg2＋具有極高的選擇性.

杉木(Cunninghamia lanceolata)是我國(guó)南方地區(qū)常用的一種經(jīng)濟(jì)用速生樹(shù)種，分布范圍較廣，具有生長(zhǎng)迅速、材質(zhì)細(xì)致、易加工和用途廣等特點(diǎn)，在全國(guó)林業(yè)生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位.本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)杉木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)有5條與鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)核酸序列，保守域檢測(cè)結(jié)果顯示這5條序列屬于EamA超家族，具有Mg＿trans＿NIPA結(jié)構(gòu)域，經(jīng)bastx在線(xiàn)分析，這些序列與擬南芥的NIPAs具有同源性，故分別命名為NIPA3、NIPA4、NIPA5、NIPA6和NIPA8.在對(duì)不同杉木家系進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，52號(hào)家系有新葉黃化嚴(yán)重的植株，與正常的杉木相比，黃化葉植株長(zhǎng)勢(shì)較差，且植株矮小.鎂作為關(guān)鍵的營(yíng)養(yǎng)元素，在杉木中的研究卻少之又少.為了豐富杉木在鎂轉(zhuǎn)運(yùn)方面的研究，本試驗(yàn)以杉木52號(hào)家系不同表型杉木幼苗為研究對(duì)象，選擇Y52(黃化苗)和G52(正常苗)幼苗不同部位的組織為材料，以杉木EF1α為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)幼苗NIPAs基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析，同時(shí)測(cè)定幼苗新葉和老葉的葉綠素含量，探討杉木鎂轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的NIPAs基因在不同幼苗中的表達(dá)模式與幼苗葉綠素含量的關(guān)系，以期為杉木鎂轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的試驗(yàn)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

選擇福建省尤溪國(guó)有林場(chǎng)杉木三代種子園中的52號(hào)杉木家系正常苗(G52)和黃化苗(Y52)種子為材料進(jìn)行育苗，以1年生杉木幼苗(圖1B)作為本研究的試驗(yàn)對(duì)象，選擇幼苗不同組織部位作為試驗(yàn)材料.從頂尖自上向下截取3 cm，收集新葉和新莖；從綠色莖段和褐色莖段節(jié)點(diǎn)處自下向上截取3 cm，收集老葉和中莖；從根部與莖的節(jié)點(diǎn)處自下向上截取3 cm，收集老莖；所有根須收集備用(圖1A).

1.2 方法

1.2.1 幼苗葉片葉綠素含量的測(cè)定 取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗的新葉和老葉，分裝于離心管中，將2株幼苗相同部位的樣品混合均勻，作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共3個(gè)重復(fù)，利用浸提法[12]提取葉綠素.將0.2 g的鮮葉研磨至粉末，轉(zhuǎn)移至5 mL離心管并加入3 mL的80%丙酮充分混勻，靜置5 min后離心取上清液.在663和645 nm處測(cè)定上清液吸光值，代入公式計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量和葉綠素a/b[13].

1.2.2 總RNA提取和cDNA的合成 分別取2種幼苗的新葉、老葉、新莖、中莖、老莖和根6個(gè)部位的組織作為材料進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，將兩株幼苗相同部位的樣品混合均勻，作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共3個(gè)重復(fù).按照天根多糖多酚RNA提取試劑盒的方法對(duì)0.1 g不同部位的杉木幼苗組織進(jìn)行總RNA的提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).采用TransScript one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis superMix試劑盒合成cDNA用于qPCR擴(kuò)增.

1.2.3NIPAs基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析 本實(shí)驗(yàn)室杉木轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到5條鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的編碼基因NIPAs(nonimprinted in prader-willi/angelman)的轉(zhuǎn)錄本序列，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)qPCR特異性引物，選擇杉木EF1α為內(nèi)參基因.以稀釋10倍的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋篶DNA 2 μL，PCR H2O 7.2 μL，superMix 10 μL，引物各 0.4 μL，總反應(yīng)體系 20 μL；PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 600 s；95 ℃變性5 s，60℃退火30 s，反應(yīng)45個(gè)循環(huán)；60℃延伸60 s.運(yùn)用2-△△Ct計(jì)算方法進(jìn)行NIPAs基因的相對(duì)表達(dá)量的分析.以上試驗(yàn)所用到的引物如表1所示.

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design

2 結(jié)果與分析

2.1 幼苗葉片葉綠素含量的分析

分別測(cè)定了黃化苗和正常苗的葉片葉綠素含量，結(jié)果表明(表2)，黃化的Y52幼苗新葉的葉綠素a、葉綠素b和總含量均顯著低于正常型；老葉的葉綠素a含量高于正常型，但葉綠素b和總含量顯著低于正常型.與正常型相比，Y52幼苗新葉的葉綠素a減少76.09%，葉綠素b減少90.91%，總含量減少了83.33%；老葉的葉綠素a增加了4.44%，葉綠素b減少了50%，總含量減少了25.74%.以上數(shù)據(jù)表明，在Y52幼苗新葉中葉綠素a和b都顯著減少，尤其是葉綠素b的含量在老葉和新葉中均顯著減少，可能因?yàn)槿~綠素的合成或者葉綠體的發(fā)育存在一定的異常.

表2 幼苗葉片葉綠素含量1)Table 2 Chlorophyll content in new and old leaves of Chinese fir seedlings

2.2 總RNA提取和cDNA的合成

根據(jù)試劑盒試驗(yàn)方法提取杉木幼苗組織RNA，并采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法和酶標(biāo)儀法檢測(cè)RNA的完整性和純度.凝膠電泳結(jié)果顯示，28S和18S條帶清晰，說(shuō)明RNA無(wú)降解，完整性良好；D260/280nm的測(cè)定值為1.8～2.0，說(shuō)明無(wú)DNA污染.合成cDNA第一條鏈，以稀釋10倍的cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增.

2.3 NIPAs基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析

圖2A所示，在G52幼苗中，NIPA3在新葉和中莖部位的相對(duì)表達(dá)量最高，老莖和根部次之，老葉和新莖中最低；而Y52幼苗中，NIPA3相對(duì)表達(dá)量的高低順序則依次是新葉、中莖＞新莖＞老莖、根＞老葉.與G52相比，NIPA3在Y52幼苗的中莖、老莖和根中的表達(dá)模式并無(wú)明顯變化；但在新葉、老葉和新莖中，NIPA3的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，分別增加了56.19%、91.49%和200%，新莖的表達(dá)量增幅最大.

圖2B所示，在G52幼苗中，NIPA4只在老莖中有較高水平的表達(dá)量，其他部位的NIPA4表達(dá)水平均較低且基本一致；在Y52幼苗中，NIPA4相對(duì)表達(dá)量的高低順序依次是中莖、根＞老莖＞新葉、新莖＞老葉.與G52相比，在Y52幼苗中，老莖中NIPA4的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，減少了62.18%，其他部位的相對(duì)表達(dá)量則無(wú)顯著變化.

圖2C所示，在G52幼苗中，NIPA5在老莖中相對(duì)表達(dá)量最高，中莖次之，其他部位則相對(duì)表達(dá)量最低；在Y52幼苗中，NIPA5在中莖和老莖中相對(duì)表達(dá)量最高，其他部位的相對(duì)表達(dá)量較低且無(wú)顯著差異.與G52相比，Y52幼苗除了老莖的NIPA5相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異，新葉、老葉、新莖、中莖和根部位的NIPA5相對(duì)表達(dá)量均顯著增加，分別增加了129.41%、89.32%、123.71%、87.96%和69.78%.

圖2D所示，在G52幼苗中，NIPA6的相對(duì)表達(dá)量按高低排序依次為中莖、老莖＞新莖、根＞老葉＞新葉；在Y52幼苗中，其相對(duì)表達(dá)量高低順序?yàn)槔锨o、根＞中莖＞新葉、新莖＞老葉.與G52相比，NIPA6在Y52幼苗老莖和根的相對(duì)表達(dá)量異常顯著，分別增加了535.68%和556.17%，其增加量高達(dá)約5倍，新葉和中莖的NIPA6相對(duì)表達(dá)量同樣有顯著增加，分別增加了140.78%和86.91%.

圖2E所示，在G52幼苗中，NIPA8的相對(duì)表達(dá)量在中莖和老莖中最高，其次是根，最低的是新葉、老葉和新莖；在Y52幼苗中，NIPA8相對(duì)表達(dá)量的高低順序則是新葉＞新莖＞老葉、中莖＞老莖＞根.與G52相比，Y52幼苗各個(gè)部位的NIPA8的相對(duì)表達(dá)量都存在顯著性差異，新葉、老葉和新莖中NIPA8均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量分別增加了151.92%、53.33%和101.05%；中莖、老莖和根中NIPA8均出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量分別減少了54.71%、66.45%和73.63%.

圖2 杉木NIPAs基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of NIPAs gene in different tissues of Chinese fir

3 結(jié)論

本試驗(yàn)為了揭示杉木52家系不同表型杉木幼苗的差異與鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因NIPAs之間的關(guān)系，以Y52(黃化苗)和G52(正常苗)幼苗不同部位的組織為材料，選擇杉木EF1α為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)幼苗NIPAs基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析，以及選擇幼苗新葉和老葉進(jìn)行葉綠素含量的測(cè)定.結(jié)果表明，Y52幼苗新葉中葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量都顯著降低；老葉中，葉綠素a含量有所增加，但葉綠素b和總?cè)~綠素含量仍顯著降低，可能因?yàn)槿~綠素的合成或者葉綠體的發(fā)育存在一定的異常.在葉綠素合成途徑中，鎂參與了該途徑的酶催反應(yīng)，而葉綠素b是由葉綠素a經(jīng)葉綠素酸酯a加氧酶催化轉(zhuǎn)化而成[14].有研究表明[15]，鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MGT10對(duì)葉綠體的發(fā)育和光合作用起著至關(guān)重要的作用.所以Y52黃化葉葉綠素含量的減少可能是因?yàn)殒V運(yùn)輸或者鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白出現(xiàn)某種問(wèn)題所致，而老葉葉綠素b減少，葉綠素a增加，可能是酶活性受到干擾.

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在G52幼苗中，NIPA3相對(duì)表達(dá)量在新葉和中莖中最高，NIPA4相對(duì)表達(dá)量在老莖中最高，NIPA5相對(duì)表達(dá)量在老莖和中莖中最高，NIPA6相對(duì)表達(dá)量在中莖和老莖中最高，NIPA8相對(duì)表達(dá)量在中莖和老莖中最高.因此，除了NIPA3在新葉中表達(dá)，其他的NIPAs基因主要在成熟莖中高表達(dá).Davidassael et al[9]的研究表明，AtMHX在韌皮部高度表達(dá)，韌皮部主要的作用是輸送營(yíng)養(yǎng)成分.有研究表明[16]，MGT6在維持植物體內(nèi)鎂穩(wěn)態(tài)平衡中扮演著重要角色.所以杉木的NIPAs基因在莖中高度表達(dá)也可能是有助于Mg2＋自下而上的運(yùn)輸，以維持地上部分的鎂穩(wěn)態(tài).在Y52幼苗中，NIPA3相對(duì)表達(dá)量在新葉和中莖中最高，NIPA4相對(duì)表達(dá)量在中莖和根中最高，NIPA5相對(duì)表達(dá)量在老莖和中莖中最高，NIPA6相對(duì)表達(dá)量在老莖和根中最高，NIPA8相對(duì)表達(dá)量在新葉和新莖中最高.因此，NIPAs基因在Y52的不同部位都有高度表達(dá).對(duì)G52和Y52幼苗的NIPAs表達(dá)差異進(jìn)行分析，結(jié)果表明，NIPA3僅在葉片和新莖中表達(dá)量顯著增加；NIPA4僅在老莖中表達(dá)量顯著降低；NIPA5則除了在老莖中表達(dá)量無(wú)顯著變化外，其他部分均顯著增加；NIPA6除了老葉和新莖表達(dá)量無(wú)顯著變化外，其他部分均顯著增加；NIPA8在葉片和新莖中表達(dá)量顯著增加，中莖、老莖和根中的表達(dá)量顯著降低.綜上所述，杉木NIPAs具有一定的組織特異性，兩種幼苗葉片的差異可能與NIPA3、NIPA5、NIPA6和NIPA8具有一定相關(guān)性.而NIPA4和NIPA8在幼苗下半部表達(dá)量的降低極有可能會(huì)影響Mg2＋的吸收與運(yùn)輸，所以導(dǎo)致部分NIPAs在幼苗上半部的高度表達(dá)，促使Mg2＋向綠色組織運(yùn)輸，維持正常的生命活動(dòng).