諸葛菜種子抗真菌蛋白的提取及其抑菌活性

張瑋瑋，袁素素，王財成，葉秀娟

(福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，福建福州350002)

抗菌蛋白是植物在長期進(jìn)化過程中產(chǎn)生的具有抗微生物活性的一類防御性蛋白[1]，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分.由于抗菌蛋白具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性、低毒性等特點(diǎn)，極有可能成為一類新型抗菌素或植物源殺菌劑[2].眾多研究人員已經(jīng)從多種植物中分離出抗菌蛋白，并對其結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)理等進(jìn)行了研究.例如：Ye et al[3]從甘藍(lán)(Brassica oleracea)種子中分離出一種分子質(zhì)量約為30 ku的蛋白，其對落花生球腔菌(Mycosphaerella arachidicola)、白色念珠菌(Candida albicans)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)均具有抑制作用，且該蛋白可以抑制鼻咽癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖；Lin et al[4]從芥藍(lán)(Brassica alboglabra)中純化出的抗真菌蛋白(5 907 u)能夠有效抑制尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、玉蜀黍長蠕孢(Helminthosporium maydis)、落花生球腔菌和蘋果黑腐皮殼菌(Valsa mali)的生長，還可以抑制肝癌細(xì)胞HepG2和乳腺癌細(xì)胞MCF7的增殖；Lin et al[5]還從蕓薹(Brassica campestris)中分離出抗真菌蛋白campesin(9.4 ku)，該蛋白可以抑制尖孢鐮刀菌和落花生球腔菌的生長，對HepG2和MCF癌細(xì)胞的增殖也有抑制作用.隨著研究的深入，這些天然活性產(chǎn)物的應(yīng)用將更加廣泛.

諸葛菜(Orychophragmus violaceus)系十字花科諸葛菜屬，因農(nóng)歷二月前后開藍(lán)紫色花，又稱二月藍(lán)、翠紫花[6].諸葛菜營養(yǎng)價值較高，其根、莖和葉均可食用[7].諸葛菜種子富含維生素B1、維生素B2、維生素C和胡蘿卜素以及鐵、鈣等礦質(zhì)元素[8-11]；其含油量高達(dá)35.8%，其中，棕櫚酸、油酸和亞油酸含量較高，而亞麻酸和芥酸含量低，是非常優(yōu)質(zhì)的油料資源[12-14].目前，學(xué)者們已從十字花科多種植物如大白菜[15]、高菜[16]等中分離出抗真菌蛋白，但是有關(guān)諸葛菜種子中的抗真菌蛋白還未見報道.因此，本研究以諸葛菜種子為試驗材料，分離純化其抗真菌蛋白，并測定該蛋白的抑菌活性和穩(wěn)定性，為促進(jìn)諸葛菜抗真菌蛋白的應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

諸葛菜種子：購買于江蘇省宿遷市四季青種業(yè)有限公司.

15種供試植物病原真菌：尖孢鐮刀菌、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、芭樂炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、長柄鏈格孢菌(Alternaria longipes)、煙草炭疽病菌(Colletotrichum micotianae)、玉蜀黍長蠕孢、小白菜炭疽(Colletotrichum higginsianum)、落花生球腔菌、突臍蠕孢菌(Exserohilum turcicum)、茄病鐮刀菌(Fusarium solani)、蘋果黑腐皮殼菌、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsis microspora)均由福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室提供.

儀器：Centrifuge 5860R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)，LGJ-18S冷凍干燥機(jī)(上海松源華興科技發(fā)展有限公司)，AKTA pure快速蛋白純化系統(tǒng)(瑞典GE公司)，SPX-250智能恒溫培養(yǎng)箱(寧波賽福實(shí)驗儀器廠).

1.2 抗真菌蛋白的分離、純化

取150 g諸葛菜種子，加入20 mmol·L-1醋酸銨緩沖液(pH 4.6)800 mL，經(jīng)豆?jié){機(jī)粉碎后置于4℃勻漿浸提12 h，離心(8 000 r·min-1，30 min)后取上清液備用.將上清液上樣于SP-Sepharose陽離子交換層析柱(5.0 cm×20 cm)，依次用含0.2、0.5和1.0 mol·L-1NaCl的20 mmol·L-1醋酸銨緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，在280 nm波長下檢測洗出液的光密度.將各組分收集，以尖孢鐮刀菌為指示菌檢測各組分抑菌活性.

將有活性的組分透析，冷凍干燥后進(jìn)一步用Mono STM5/50 GL強(qiáng)陽離子交換柱分離，該柱預(yù)先用20 mmol·L-1醋酸銨緩沖液平衡，用0～1.0 mol·L-1NaCl梯度洗脫，收集各洗脫峰，以尖孢鐮刀菌為指示菌檢測各洗脫峰抑菌活性.

將有活性的組分透析并冷凍干燥，用20 mmol·L-1醋酸銨緩沖液溶解后上樣于SuperdexTMPeptide 10/300 GL凝膠層析柱，收集各洗脫峰，以尖孢鐮刀菌為指示菌檢測各洗脫峰抑菌活性，并收集活性組分，透析并冷凍干燥.

1.3 蛋白分子質(zhì)量測定

Tricine-SDS-PAGE電泳方法參考文獻(xiàn)[3]，分離膠濃度16.5%，夾層膠濃度10%，濃縮膠濃度4%.初始電壓為30 V，電泳1 h后調(diào)至80 V，再繼續(xù)電泳2.5 h.電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色2 h，再用脫色液(10%甲醇和10%乙酸)進(jìn)行脫色.

1.4 蛋白質(zhì)譜分析

將電泳檢測為單一條帶的樣品經(jīng)胰蛋白酶酶解后，用LCMSMS(nanoLC-QE)進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過MASCOT等質(zhì)譜匹配軟件分析LCMSMS數(shù)據(jù)，通過UniProtKB數(shù)據(jù)庫檢索、比對、鑒定分離得到的蛋白質(zhì).質(zhì)譜分析由上海中科新生命生物科技有限公司完成.

1.5 蛋白的抗真菌活性檢測

用紙片擴(kuò)散法[17]進(jìn)行測定.將待測的植物病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)，待菌落生長至圓面直徑為3.0～3.5 cm時，將滅菌的圓濾紙片放在距離菌絲邊緣0.5 cm處，各取15 μL蛋白樣品和對照(PBS緩沖液，pH 7.4)加在濾紙片上，28℃恒溫培養(yǎng)至菌落生長到濾紙片邊緣時，觀察有無抑菌活性.

1.6 蛋白對尖孢鐮刀菌生長半抑制濃度(IC50)的測定

采用瓊脂平板稀釋法[17]進(jìn)行測定.將蛋白樣品用PBS緩沖液配制成一系列濃度，并經(jīng)0.22 μm濾頭過濾除菌.加熱融化0.7%PDA培養(yǎng)基，待冷卻至40～50℃時，取0.5 mL蛋白溶液(對照組為0.5 mL PBS緩沖液)與1.5 mL培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿(30 mm×15 mm)中混勻，用打孔器截取相同大小真菌菌塊，置于培養(yǎng)皿中心，封口并轉(zhuǎn)移至28℃恒溫培養(yǎng)，直至對照組菌落生長至培養(yǎng)皿邊緣.用十字交叉法測量真菌菌落的生長直徑，并計算該蛋白對尖孢鐮刀菌生長的抑菌率，每組3個重復(fù).運(yùn)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Probit回歸分析，計算IC50.

1.7 蛋白對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)IC50的測定

1.7.1 孢子制備 將尖孢鐮刀菌接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)7～15 d，取5 mL無菌水加入上述培養(yǎng)皿中，用涂布器在真菌表面來回刮動，濾除菌絲得到孢子懸液.稀釋孢子懸液至濃度為1×106～1×107CFU·mL-1，取等體積孢子懸液與0.05%葡萄糖溶液混合備用.

1.7.2 孢子萌發(fā)抑制率的測定 用凹玻片法[18-19]進(jìn)行測定.將蛋白樣品用PBS緩沖液配制成一系列濃度，并經(jīng)0.22 μm濾頭過濾除菌.取10 μL孢子懸浮液(對照組為PBS緩沖液)與10 μL蛋白溶液混勻，加在凹玻片中央，置于含有兩層浸濕的無菌濾紙片的培養(yǎng)皿(90 mm×15 mm)中，28℃恒溫保濕培養(yǎng)至對照組孢子萌發(fā)率達(dá)到90%以上時，將各培養(yǎng)皿放入4℃冰箱中.6 h后用光學(xué)顯微鏡觀察并記錄孢子萌發(fā)數(shù)，每組至少觀察100個孢子，每組3個重復(fù)，計算孢子萌發(fā)抑制率.運(yùn)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Probit回歸分析，計算IC50.

1.8 蛋白的穩(wěn)定性檢測

1.8.1 熱穩(wěn)定性 取5個1.5 mL離心管，分別加入抗真菌蛋白(用PBS緩沖液溶解，pH 7.4)0.1 mL，其中4管分別在40、60、80、100℃條件下水浴15 min(待冷卻至室溫時進(jìn)行試驗)，1管未處理作為陽性對照，另取1個離心管加入PBS緩沖液0.1 mL作為陰性對照.以尖孢鐮刀菌作為指示菌，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗，每組設(shè)3個重復(fù).

1.8.2 pH穩(wěn)定性 取7個1.5 mL離心管，分別加入抗真菌蛋白(用PBS緩沖液溶解，pH 7.4)0.1 mL，其中6管分別加入調(diào)配好的pH值為1、3、5、10、12、14的PBS緩沖液0.1 mL，1管未處理作為陽性對照，另取1個離心管加入PBS緩沖液0.1 mL作為陰性對照，室溫放置1 h.抑菌試驗方法同1.8.1.

1.8.3 有機(jī)溶劑穩(wěn)定性 取6個1.5 mL離心管，分別加入抗真菌蛋白(用PBS緩沖液溶解，pH 7.4)0.1 mL，其中5管分別加入用PBS緩沖液配制的15%(v/v)甲醇、乙醇、異丙醇、乙醚、丙酮溶液0.1 mL，1管未處理作為陽性對照，另取5個離心管分別加入15%甲醇、乙醇、異丙醇、乙醚、丙酮0.1 mL作為陰性對照，室溫放置1 h.抑菌試驗方法同1.8.1.

1.8.4 金屬離子穩(wěn)定性 用 PBS 緩沖液分別配制 50、100、150、200、250 mmol·L-1的 Mg2＋、K＋、Mn2＋、Ca2＋溶液.取6個1.5 mL離心管，分別加入抗真菌蛋白(用PBS緩沖液溶解，pH 7.4)0.1 mL，其中5管分別加入50、100、150、200、250 mmol·L-1Mg2＋溶液 0.1 mL，1 管未處理作為陽性對照，以 250 mmol·L-1Mg2＋溶液作為陰性對照，室溫放置1 h.K＋、Mn2＋、Ca2＋溶液按照同樣的方法進(jìn)行處理.抑菌試驗方法同1.8.1.

1.9 數(shù)據(jù)處理

用Excel和SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 抗真菌蛋白的分離、純化

諸葛菜種子蛋白上清液經(jīng)SP-Sepharose陽離子交換柱分離后，得到4個洗脫組分a、b、c、d(圖1A)；以尖孢鐮刀菌為指示菌，用濾紙片法測得b組分具有抗真菌活性(圖1B)，所以將b組分進(jìn)一步純化.b組分經(jīng)Mono STM5/50 GL強(qiáng)陽離子交換柱分離后，得到5個洗脫峰e、f、g、h、i(圖1C)；抑菌活性檢測結(jié)果顯示g洗脫峰具有抗真菌活性(圖1D)，所以選擇g組分進(jìn)一步純化.將g組分上樣于SuperdexTMPeptide 10/300 GL凝膠層析柱進(jìn)一步分離，得到j(luò)、k、l、m共4個洗脫峰(圖1E)；抑菌活性檢測結(jié)果表明l洗脫峰具有抗真菌活性(圖1F).

圖1 諸葛菜種子抗真菌蛋白的分離層析及各組分活性檢測結(jié)果Fig.1 Column chromatography and activity detection of the antifungal protein from O.violaceus seeds

Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖2)表明，諸葛菜種子抗真菌蛋白經(jīng)過3步分離純化后，Ⅰ組分蛋白呈單一條帶，說明已達(dá)到較高純度，其相對分子質(zhì)量約為10 ku，將該蛋白命名為Zp.

2.2 質(zhì)譜分析結(jié)果

將Tricine-SDS-PAGE電泳得到的單一條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析，在UniProtKB數(shù)據(jù)庫中檢索，結(jié)果如表1所示.經(jīng)蛋白相似度和序列比對發(fā)現(xiàn)，Zp蛋白可能是諸葛菜種子中的一種防御素蛋白(defensin)，在UniProtKB數(shù)據(jù)庫中的序列號為C9WGT1，相對分子質(zhì)量為8 737.17 u，這與電泳得出的Zp蛋白分子質(zhì)量較為接近.

圖2 諸葛菜種子抗真菌蛋白的Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.2 Tricine-SDS-PAGE electrophoresis of the antifungal protein from O.violaceus seeds

表1 Zp蛋白的質(zhì)譜鑒定與UniProtKB數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果Table 1 Mass spectrometry and database retrieva(UniProtKB)of Zp protein

2.3 Zp蛋白的抗真菌活性

Zp蛋白的抗真菌效果如圖3所示，其對稻瘟病菌、灰葡萄孢菌、突臍蠕孢菌、煙草炭疽病菌、蘋果黑腐皮殼菌、芭樂炭疽病菌、小白菜炭疽、玉蜀黍長蠕孢、落花生球腔菌、小孢擬盤多毛孢和尖孢鐮刀菌共11種植物病原真菌均具有抑制作用，而對茄病鐮刀菌、辣椒疫霉、長柄鏈格孢菌和禾谷鐮刀菌等4種真菌沒有明顯的抑制作用.由此可知，諸葛菜種子抗真菌蛋白具有一定的廣譜性.

圖3 Zp蛋白的抗真菌效果Fig.3 Antifungal effects of the Zp protein from O.violaceus seeds

2.4 Zp蛋白對尖孢鐮刀菌生長的IC50

Zp蛋白對尖孢鐮刀菌生長的抑制效果如圖4A所示.隨著Zp蛋白濃度的增大，對尖孢鐮刀菌生長的抑制率逐漸升高，當(dāng)Zp蛋白濃度為142.5 μg·mL-1時，對尖孢鐮刀菌的抑制率超過60%(圖4B).Zp蛋白對尖孢鐮刀菌生長抑制的Probit回歸方程：Probit(p)＝-1.530＋0.882x.由此得出Zp蛋白對尖孢鐮刀菌生長的 IC50為 54.36 μg·mL-1.

圖4 Zp蛋白對尖孢鐮刀菌生長的抑制效果Fig.4 Inhibtory effects of Zp protein on the growth of F.oxysporum

2.5 Zp蛋白對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的IC50

Zp蛋白可以抑制尖孢鐮刀菌孢子的萌發(fā)：與對照組相比，處理組孢子萌發(fā)數(shù)顯著減少，且萌發(fā)的牙管較短，有的孢子形態(tài)膨大加粗，甚至出現(xiàn)畸形(圖5A).隨著Zp蛋白濃度增大，對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制率逐漸升高，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?8.85 μg·mL-1時，孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到60%(圖5B).Zp蛋白對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)抑制的Probit回歸方程：Probit(p)＝-1.449＋1.204x.由此得出Zp蛋白對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的 IC50為 15.97 μg·mL-1.

2.6 Zp蛋白的穩(wěn)定性

從圖6A可看出，Zp蛋白在40、60、80、100℃水浴處理15 min后，對尖孢鐮刀菌的抑制活性基本保持不變，表明該蛋白的熱穩(wěn)定性良好.由圖6B可知，Zp蛋白在經(jīng)不同pH值的溶液處理后，對尖孢鐮刀菌仍有較強(qiáng)的抑制作用，說明該蛋白的耐酸堿性較強(qiáng).

圖5 Zp蛋白對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制效果Fig.5 Inhibtory effects of Zp protein on the germination of F.oxysporum spores

圖6 Zp蛋白的穩(wěn)定性Fig.6 Stability of Zp protein

由圖6C、6D可知，經(jīng)15%甲醇、乙醇、異丙醇、乙醚、丙酮溶液處理過的Zp蛋白能夠明顯抑制尖孢鐮刀菌的生長，而單獨(dú)的相應(yīng)有機(jī)溶劑對尖孢鐮刀菌生長并沒有抑制作用，由此說明該蛋白對有機(jī)溶劑具有一定的耐受性.由圖 6E、6F、6G、6H 可知，不含 Zp 蛋白的 250 mmol·L-1Ca2＋、Mg2＋、Mn2＋、K＋溶液對尖孢鐮刀菌生長沒有抑制作用，而含有該蛋白的不同濃度(50、100、150、200、250 mmol·L-1)金屬離子溶液對尖孢鐮刀菌生長具有明顯的抑制作用，說明Zp蛋白在強(qiáng)陽離子溶液中活性穩(wěn)定.

3 討論與結(jié)論

本研究從諸葛菜種子中分離出一種分子質(zhì)量約為10 ku的抗真菌蛋白Zp.Zp蛋白對多種植物病原真菌均具有抑制作用，其中對尖孢鐮刀菌生長的IC50為54.36 μg·mL-1，對其孢子萌發(fā)的IC50為15.97 μg·mL-1.抗真菌蛋白存在于十字花科的多種植物種子中，且這些蛋白對多種植物病原真菌具有抑制活性.例如：油菜(Brassica napus)種子中分離出的抗真菌蛋白(9 412 u)對尖孢鐮刀菌和落花生球腔菌的IC50分別為78.12和42.35 μg·mL-1[20]；甘藍(lán)種子中純化出分子質(zhì)量為30 ku的抗真菌蛋白，對落花生球腔菌的IC50為150 μg·mL-1[3]；芥藍(lán)種子中純化出分子質(zhì)量為5 907 u的抗真菌蛋白，對尖孢鐮刀菌、玉蜀黍長蠕孢、落花生球腔菌和蘋果黑腐皮殼菌的IC50分別為25.40、12.40、14.18和0.89 μg·mL-1[4].由此可知，Zp蛋白的抗真菌活性較強(qiáng).經(jīng)質(zhì)譜鑒定，Zp蛋白可能是諸葛菜種子中的一種防御素蛋白.Chan et al[21]已經(jīng)從褐色蕓豆(Phaseolus vulgaris)的種子中分離出一種防御素類蛋白，分子質(zhì)量為5.4 ku，該蛋白也具有抗真菌活性.防御素類蛋白是植物抗菌蛋白中數(shù)目最多的一個種類且具有廣譜的抗菌活性[22].通過對Zp蛋白的抑菌活性進(jìn)行檢測可知，其對尖孢鐮刀菌等11種真菌都有較強(qiáng)的抑制活性，表明該蛋白具有抑菌廣譜性.防御素類蛋白還具有典型的三維穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[23].檢測可知，Zp蛋白具有良好的耐熱、耐酸堿性；已有研究發(fā)現(xiàn)，油菜種子抗菌蛋白和芥藍(lán)種子抗菌蛋白也具有熱穩(wěn)定性和強(qiáng)酸強(qiáng)堿穩(wěn)定性[4，24-25].Zp蛋白對有機(jī)溶劑和金屬離子也具有一定的耐受能力；Terras et al[26]研究表明，蘿卜(Raphanus sativus)種子Rs-AFP1和Rs-AFP2抗菌蛋白在K＋溶液(50 mmol·L-1)中具有抑菌活性，且抑菌活性穩(wěn)定.油菜、芥藍(lán)、蘿卜以及諸葛菜都屬十字花科植物，說明十字花科多種植物種子中分離出的抗真菌蛋白具有一定的共性.

綜上所述，Zp蛋白抑菌譜廣，抑菌活性穩(wěn)定，具有潛在的應(yīng)用價值.但有關(guān)諸葛菜種子抗真菌蛋白抑制植物病原真菌生長的具體作用機(jī)理還有待研究.