基于UPLC-Q-TOF-MS法分析百合珠芽化學成分及其薯蕷皂苷元抗腫瘤活性研究

袁志鷹，羅林明,陳乃宏, ， 梁 晟，周小江*，黃惠勇*，陳妍羽

1湖南中醫(yī)藥大學；2湖南省中藥飲片標準化與功能工程技術中心，長沙 410208；3中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京100050；4湖南省藥品檢驗研究院，長沙 410001

百合(Liliibulbus)為多年生草本植物，始載于漢朝《神農(nóng)本草經(jīng)》，2015版《中國藥典》收錄為卷丹(LiliumlancifoliumThunb.)、百合(LiliumbroumiiF.E.Brown var.viridulumBaker)、細葉百合(LiliumpumilumDC.)3個品種[1～2]。百合藥用部位主要為鱗莖及其珠芽(百合子)，百合鱗莖研究報道較多，而百合珠芽由于研究較少，資源浪費嚴重?，F(xiàn)代研究顯示，百合珠芽中含有黃酮類、多酚類和生物堿等多種活性成分，具有抗氧化的生物活性[3]。

目前分析百合鱗莖、珠芽中化學成分的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[4,5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)等方法[7]，其中HPLC法操作簡便，目前主要用來測定百合鱗莖中酚酸甘油酯、沒食子酸等成分。GC-MS法主要用于分析百合鱗莖中揮發(fā)性成分，具有一定的局限性。HPLC-Q-TOF-MS法靈敏度高，并且可以用來鑒定復雜基質(zhì)中的化學成分[8,9]，但分析速度一般。UPLC-Q-TOF-MS法具有快速、準確和靈敏度高的特點，成為中藥分析領域重要技術手段[10-12]。目前，采用UPLC-Q-TOF-MS法快速分析百合珠芽中化學成分尚未見于報道。近年來，腫瘤已成為中國死亡率最高的疾病之一[13]，而薯蕷皂苷屬于甾體皂苷，可顯著抑制肺癌A549、NCI-H460和NCI-H446細胞增殖，在體外具有較強的抗肺癌作用[14]，同時還能明顯抑制人胃癌細胞MGC-803、SGC-7901的增殖并誘導其凋亡[15,16]。薯蕷皂苷水解即可得到薯蕷皂苷元，而目前采用CCK8法研究薯蕷皂苷元抗肺腫瘤A549細胞、胃腫瘤HGC-27細胞的藥效篩選以及百合珠芽中是否含有薯蕷皂苷尚未見報道，值得我們?nèi)ヌ接憽?/p>

本試驗在前期對百合鱗莖研究的基礎上，采用UPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用技術可快速分析鑒定百合珠芽中主要化學成分，并采用CCK-8法進行薯蕷皂苷元腫瘤細胞增殖分析研究，對百合珠芽產(chǎn)品生產(chǎn)、加工和利用具有深層次指導意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

202型電熱恒溫干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 QTof/MS(美國Waters 公司)；Agilent UPLC 2010(安捷倫科技公司)；METTLER TOLEDO ML204電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，KM-250DE臺式超聲波清洗儀(昆山美美超聲儀器有限公司)，80-1型電動離心機(城西曉陽電子儀器廠)；96孔板(美國corning公司)、CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)、超凈臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)、ELx 800酶標儀(美國Bio Tek 公司)。

1.2 藥品與試劑

百合珠芽采于湖南龍山和順百合種植基地，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學周小江教授鑒定為百合科植物卷丹(LiliumlancifoliumThunb.)的珠芽部分。薯蕷皂苷元(B2117，上海源葉生物科技有限公司)；甲醇(色譜純，德國默克公司)；乙腈(色譜純，德國默克公司)，王百合苷A(0252-DT01，上海standard 科技公司)。人胃癌細胞SGC-7901、人胃癌細胞HGC-27、人肺癌細胞A549(中科院上海細胞庫)；高糖DMEM培養(yǎng)基、FBS、PBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(美國Gibco 公司)；順鉑(CDDP，美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司)；青霉素鏈霉素(美國HyCLone公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC-Q-TOF-MS分析百合珠芽中化學成分

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Thermo Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流動相：乙腈-0.5%乙酸，梯度洗脫，流速：0.2 mL/min，柱溫30 ℃，波長：309 nm，進樣體積：2.00 μL。采用UPLC-MS/MS(正離子、負離子模式)，離子化方式：電噴霧離子化(ESI)，ESI-毛細管電壓 2.8 kV，錐孔電壓28 V，錐孔氣流50 L/h；ESI+毛細管電壓 3.0 kV，錐孔電壓30 V，錐孔氣流50 L/h。ESI+，ESI-離子化干燥氣溫度均為：T=350 ℃，V=600 L/h。流動性梯度洗脫程序見表1。

2.1.2 供試品溶液的制備

將采集的百合新鮮珠芽，洗凈，再放入60 ℃鼓風干燥箱中60 min，得干百合珠芽，粉碎過100目，精密稱定過篩的樣品1.0 g至量瓶中，加入50 mL 80%乙醇，用超聲儀提取40 min。冷卻至室溫，精密稱定，補足80% 乙醇，濾過，濾液旋蒸至干，加入10 mL 80% 乙醇溶解過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，既得。

以國家土壤環(huán)境質(zhì)量標準為評價標準，單因子污染指數(shù)評價法可用于評價土壤重金屬污染程度，分析土壤環(huán)境質(zhì)量對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響程度。具體分級指標為：P綜≤0.7，土壤環(huán)境質(zhì)量處于清潔安全狀態(tài)；P綜 1時，表明土壤重金屬含量超標污染，對作物生長發(fā)育有影響，進而會通過食物鏈影響人體的健康；1 3為重度污染。

表1 梯度洗脫程序表

2.1.3 對照品溶液的制備

精密平行稱取2份王百合苷A標準品適量，用80%乙醇溶解，稀釋配制成0.556、0.68 mg/mL的王百合苷A對照品溶液。

2.1.4 超聲提取優(yōu)化試驗

按2.1.2項下方法得到干百合珠芽，精密稱定1.0 g干百合珠芽粉至量瓶中， 加入50 mL 80%乙醇，用超聲儀在不同提取時間條件下(10、20、30、40、50 min)處理后，冷卻至室溫，精密稱定，補足80% 乙醇，搖勻過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，既得待測液。在前期研究中，課題組發(fā)現(xiàn)與其他成分比較，百合珠芽中王百合苷A含量較高，因此選用王百合苷A的提取率作為百合珠芽藥材的化學成分提取考核指標。將待測液注入Agilent UPLC 2010，測定王百合苷A的含量。王百合苷提取率計算方法：提取率(%)= 提取液濃度 ×體積 /原料質(zhì)量 × 100%。

2.2 薯蕷皂苷元抗腫瘤實驗

2.2.1 細胞培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱內(nèi)取出需要復蘇的肺癌A549細胞，置于恒溫水浴鍋內(nèi)37 ℃快速解凍，用移液槍迅速將凍存管內(nèi)的解凍后的細胞液移至含4 mL 的10% FBS、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)DMEM完全培養(yǎng)液的15 mL離心管中，以800 rpm速率離心5 min，上清液棄去，加入6 mL DMEM完全培養(yǎng)液，混勻，將細胞液移至100 mm培養(yǎng)皿中，晃動培養(yǎng)皿使細胞液均勻分散，置于含5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)3～4天傳代1次。

2.2.2 細胞增殖抑制試驗

待培養(yǎng)細胞生長到對數(shù)生長期后，將細胞消化制成細胞懸液，計數(shù)，然后在96孔板中按100 μL/孔的比例接種細胞懸液(8.0×104～1.0×105個/mL)，將培養(yǎng)板放在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.2.2.2 加藥干預

從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，吸出舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 無血清含雙抗DMEM培養(yǎng)液，饑餓12 h后去掉培養(yǎng)液，5個實驗組分別加入事先配置好的含不同濃度待測藥物的DMEM完全培養(yǎng)液，溶劑對照組加入完全培養(yǎng)液，陽性對照組加入含4 μg/mL CDDP的完全培養(yǎng)液，每孔100 μL，每組設置5個副孔。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.2.2.3 加入CCK-8顯色

取出培養(yǎng)板，吸棄每孔中的細胞培養(yǎng)液，避光加入CCK-8溶液與含雙抗DMEM培養(yǎng)液，以10∶100比例新鮮配置的顯色液，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中孵育0.5～1.0 h。

2.2.2.4 檢測吸光值

將處理好的培養(yǎng)板置于酶聯(lián)免疫檢測儀中，在波長為450 nm處的檢測其OD值。

2.2.2.5 計算細胞增殖抑制率

根據(jù)每組測得的OD值，計算出藥物對受試細胞的增殖抑制率。計算方法如下：

增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%

3 結(jié)果與討論

3.1 超聲提取條件的選擇

進行了超聲提取10、20、30、40、50 min的比較試驗，發(fā)現(xiàn)40、50 min效果最佳，二者提取效率相當，故將超聲提取時間設定為40 min。具體見表2。

3.2 液相色譜條件優(yōu)化

對樣品超聲提取液進行UPLC-DAD測定，結(jié)果為309 nm時百合珠芽中多種有效成分有較大吸收峰，故選擇百合珠芽定性分析檢測波長為309 nm，(見圖1)。同時考察了thermo C18(100 mm×2.1mm，1.5 μm)，Agilent C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，waters acquity UPLC BEH-C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)， 3 種色譜柱的峰形、柱效和分離度，結(jié)果顯示，以thermo C18為最佳，這有利于質(zhì)譜定性分析。

表2 不同超聲提取時間下的王百合苷A提取效率

圖1 百合珠芽液相色譜圖(309 nm)Fig.1 Chromatography of lily bulbil(309 nm)

3.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在實驗中發(fā)現(xiàn)，單獨用UPLC圖無法很好地分離鑒定百合珠芽中復雜的化學成分。但是采用二級質(zhì)譜離子流圖可以較好地分離百合珠芽中主要化學成分。質(zhì)譜條件的選擇：ESI+模式下，毛細管電壓從2.5 kV～3.5 kV，錐孔電壓從20 V～40 V；ESI-模式下，毛細管電壓從2.0 kV～3.2 kV，錐孔電壓從20 V-35 V進行選擇。最后發(fā)現(xiàn)，在ESI-模式下，毛細管電壓 2.8 kV，錐孔電壓28 V；ESI+模式下，毛細管電壓 3.0 kV，錐孔電壓30 V，TIC圖得到的有效信息較多。

實驗采用正、負離子模式同時掃描樣品，其中在負離子模式條件下，王百合苷A、王百合苷B、王百合苷C、王百合苷E、王百合苷F、1-O-p-香豆酰甘油、1-O-阿魏酰香-3-O-p-豆酰甘油色譜峰響應值較高，而在正離子模式條件下，對香豆酸、槲皮素、薯蕷皂苷色譜峰響應值較高，為增大物質(zhì)推測的可靠性，實驗選用正、負離子模式同時測定樣品，最大程度地獲取質(zhì)譜信息，見圖2～3。

3.4 化學成分的UPLC-Q-TOF-MS鑒定

在擬定分析條件下，電噴霧電離源正離子模式和負離子模式對色譜流出物進行檢測，四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法對各主要色譜峰進行歸屬，通過一、二級質(zhì)譜圖進行分析，根據(jù)其反相色譜保留行為、紫外檢測和質(zhì)譜特征，結(jié)合文獻報道，進行結(jié)構(gòu)鑒定。在負離子模式下，共推測鑒定出7個化學成分；在正離子模式下，共推測鑒定出3個化學成分。具體質(zhì)荷比和碎片離子信息見表3。

圖2 二級質(zhì)譜離子流圖(正離子模式)Fig.2 Daughter ion flow graph of the MS-MS spectrogram in positive ion modes注：t=21.18 min，對香豆酸；t=24.21 min，槲皮素；t=27.39 min，薯蕷皂苷。Note:t = 21.18 min,p-coumaric acid;t = 24.21 min,quercetin;t = 27.39 min,dioscin.

圖3 二級質(zhì)譜離子流圖(負離子模式) Fig.3 Daughter ion flow graph of the MS-MS spectrogram in negative ion modes 注：t=20.67 min，王百合苷C；t=21.52 min，王百合苷A；t=21.79 min，1-O-p-香豆酰甘油；t=21.82 min，王百合苷F；t=22.2 min，王百合苷E；t=22.85 min，王百合苷B；t=25.08 min，1-O-阿魏酰香-3-O-p-豆酰甘油。Note:t = 20.67 min,regaloside C;t = 21.52 min,regaloside A;t = 21.79 min,1-O-p-coumaroylglycerol;t = 21.82 min,regaloside F;t = 22.2 min，Regaloside E；t = 22.85 min,regaloside B;t = 25.08 min,1-O-feruloyl-3-O-p-coumaroylglycerol.

3.5 薯蕷皂苷元(Dio)對腫瘤細胞增殖的影響

3.5.1 Dio對肺癌細胞增殖的影響

Dio在濃度范圍5～100 μM對肺腺癌A549細胞增殖具有弱抑制作用，其抑制率在8.11～15.03 %范圍內(nèi)。具體結(jié)果見表3。

3.5.2 Dio對胃癌細胞增殖的影響

5～100 μM Dio對胃癌HGC-27細胞增殖具有抑制作用，其抑制率在11.04～30.59%范圍內(nèi)，其中25～100 μM濃度組與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。具體結(jié)果見表5。

4 結(jié)論

本文建立了百合珠芽中主要化學成分的UPLC-Q-TOF-MS鑒定方法，方法快速簡便，能為百合珠芽的質(zhì)量控制及標志性成分分析提供技術參考。本文通過UPLC-Q-TOF-MS鑒定出了百合珠芽中薯蕷皂苷等10種化學成分，證實了百合珠芽中含有薯蕷皂苷，而薯蕷皂苷屬于甾體皂苷，水解即可得到薯蕷皂苷元。在此基礎上，進行了薯蕷皂苷元抗腫瘤藥效實驗，研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元對肺癌A549細胞增殖只有微弱的抑制活性，而對胃癌HGC-27細胞增殖表現(xiàn)出較強的抑制作用，其IC50值約為62786μM，并且展現(xiàn)出濃度依賴性。因此，有必要對百合珠芽化學成分進行深層次的藥效研究，課題組將繼續(xù)對鑒定出來的其他物質(zhì)進行藥效試驗研究，為更好利用百合資源提供實驗依據(jù)。

表3 百合珠芽UPLC-Q-TOF-MS分析結(jié)果

表4 Dio對肺癌A549細胞增殖的影響

注：與對照組比較,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

Note:compared with the control group,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.

表5 Dio對胃癌HGC-27細胞增殖的影響

注：與對照組比較,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

Note:compared with the control group,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.