有機(jī)溶液環(huán)境中的迷迭香酸納濾分離行為及富集工藝

李存玉，馬 赟，李紅陽，彭國(guó)平*

1南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023

低濃度有機(jī)溶液環(huán)境中中藥成分的富集多采用減壓或常壓熱濃縮處理，導(dǎo)致熱敏性有效成分解離、轉(zhuǎn)化而難以獲得。因此，在食品、醫(yī)藥行業(yè)中迫切需要一種可常溫處理，不破壞成分組成的分離技術(shù)以改善低濃度有機(jī)溶液環(huán)境下熱敏性成分的精制富集[1]。納濾是膜分離技術(shù)中的一種，截留分子量在100～1 000 Da，具有分離過程可常溫操作，無熱效應(yīng)，能耗低等技術(shù)優(yōu)勢(shì)[2]，在熱敏性活性成分分離精制等制藥、醫(yī)療領(lǐng)域具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[3-6]。

納濾分離原理主要包含道南效應(yīng)和溶解-擴(kuò)散效應(yīng)，其中道南效應(yīng)又稱電荷效應(yīng)，納濾膜荷負(fù)電性，與離子間形成靜電作用，加上立體阻礙，造成膜對(duì)離子的截留率有差異[7]。納濾膜孔與溶質(zhì)分子的相互作用，也呈現(xiàn)出在位阻效應(yīng)基礎(chǔ)上的溶解-擴(kuò)散理論，溶質(zhì)溶解在膜中，并隨著推動(dòng)力擴(kuò)散傳遞，物相之間存在化學(xué)平衡[8]。但目前對(duì)低濃度有機(jī)溶劑處理尚處于初步階段[9]，且分離機(jī)制不清晰。

迷迭香酸作為迷迭香中最有效的抗氧化成分之一，已被美國(guó)食品藥物管理局認(rèn)可為“公眾安全食品”，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、免疫抑制等作用[10]。作為一種多酚羥基化合物，分子式C18H16O8(360.31 Da)，對(duì)光照、溫度敏感[11]，在精制分離過程中，因低濃度乙醇溶液環(huán)境下的減壓加熱濃縮，存在效率低、成分存在轉(zhuǎn)化的技術(shù)難題?；谇捌趯?duì)納濾分離規(guī)律的積累，以色譜分離得到的迷迭香酸中間體為對(duì)象，探索低濃度乙醇溶液環(huán)境中下的納濾分離行為，為其精制分離提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納濾膜(聚酰胺復(fù)合膜，截留分子量150、450、800 Da)，南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司；迷迭香酸對(duì)照品(批號(hào)111871-201505，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.5%)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；迷迭香提取物(批號(hào)201505，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；迷迭香酸中間體(迷迭香提取物由色譜分離制備得到)，實(shí)驗(yàn)室自制；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TNZ-1型納濾分離設(shè)備，南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀(VWD檢測(cè)器，Agilent色譜工作站)，美國(guó)安捷倫公司；KH-250B型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，南京科爾儀器設(shè)備有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的制備

迷迭香酸對(duì)照品溶液：精密稱取迷迭香酸對(duì)照品0.015 20 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得迷迭香酸對(duì)照品溶液(1.52 mg/mL)。

迷迭香酸供試品溶液：取迷迭香酸中間體，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求的相應(yīng)濃度，加入迷迭香酸提取物，分別采用純化水或低濃度乙醇水溶液超聲溶解混勻，即得。

1.3.2 迷迭香酸的測(cè)定

色譜條件[12]：Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-1.0%磷酸水溶液(40∶60，v/v)；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25 ℃。

線性關(guān)系：精密吸取迷迭香酸對(duì)照品溶液0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 mL分別置于10 mL的量瓶中，甲醇定容至刻度，Agilent 1100高效液相色譜儀檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，得線性回歸方程：Y=12.98X-31.21，R2=0.999 9。采用高效液相色譜法，根據(jù)所測(cè)得峰面積由公式算出迷迭香酸質(zhì)量濃度，進(jìn)而計(jì)算相應(yīng)的截留率。

1.3.3 納濾分離

組裝納濾膜與TNZ-1納濾分離設(shè)備，取迷迭香酸供試品溶液置于納濾系統(tǒng)中進(jìn)行循環(huán)平衡，待迷迭香酸在納濾膜中的吸附-解吸附達(dá)到平衡時(shí)，取樣平衡液，進(jìn)而將溶液進(jìn)行納濾，待納濾完成后，取樣納濾液。

取系列平衡液和納濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液注入高效液相按“1.3.2迷迭香酸的測(cè)定”項(xiàng)下的檢測(cè)方法和線性回歸方程計(jì)算迷迭香酸濃度。

1.3.4 迷迭香酸濃度對(duì)截留率的影響

根據(jù)實(shí)際色譜分離得到的迷迭香酸溶液中間體，在20%乙醇濃度條件下，調(diào)節(jié)迷迭香酸濃度為0.01、0.05、0.15、0.50、1.00、1.50 mg/mL，采用截留分子量150、450、800 Da的納濾膜進(jìn)行分離，操作壓力1.0 MPa，待納濾完成后，根據(jù)平衡液及納濾液中迷迭香酸濃度，分別計(jì)算迷迭香酸濃度對(duì)其截留率的影響。

1.3.5 乙醇濃度對(duì)膜通量影響

在迷迭香酸濃度為0.50 mg/mL條件下，調(diào)節(jié)乙醇濃度分別為0%、5%、10%、20%、30%、40%采用截留分子量150、450、800 Da的納濾膜進(jìn)行納濾分離，操作壓力1.0 MPa，待膜通量穩(wěn)定后，收集膜通量數(shù)據(jù)。

1.3.6 乙醇濃度對(duì)迷迭香酸截留率的影響

在迷迭香酸濃度為0.50 mg/mL條件下，調(diào)節(jié)乙醇濃度分別為0%、5%、10%、20%、30%、40%的迷迭香酸供試品溶液，采用截留分子量150、450、800 Da的納濾膜進(jìn)行分離，操作壓力1.0 Mpa，待納濾完成后，根據(jù)平衡液及納濾液中迷迭香酸濃度，分析乙醇濃度對(duì)迷迭香酸截留率的影響。

1.3.7 截留率和轉(zhuǎn)移率計(jì)算

分別精密吸取納濾(或減壓濃縮)分離過程中產(chǎn)生的原液、平衡液、納濾(或濃縮)液，按上述相關(guān)項(xiàng)下的檢測(cè)條件，計(jì)算待測(cè)組分的質(zhì)量濃度，按式(1)計(jì)算截留率，按式(2)計(jì)算轉(zhuǎn)移率。

(1)

(2)

式中，R為截留率；D為轉(zhuǎn)移率；C0為原液中迷迭香酸濃度；C1為納濾液中迷迭香酸濃度；C2為平衡液中迷迭香酸濃度；C3為減壓濃縮液中迷迭香酸濃度。

1.3.8 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析因素交互作用

對(duì)含有有機(jī)試劑的迷迭香酸供試品溶液進(jìn)行納濾分離，其中乙醇濃度、迷迭香酸濃度、截留分子量對(duì)截留率具有一定影響，且三者可能存在一定的交互作用，基于此采用Design-Expert 8.06軟件，選擇乙醇濃度、溶質(zhì)濃度、截留分子量為考察因素，以-1、0、1代表變量水平，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)方案(見表1)。

表1 納濾濃縮因素與水平

1.3.9 乙醇濃度對(duì)迷迭香酸減壓濃縮的影響

采用減壓濃縮與納濾富集進(jìn)行對(duì)比，采用溫度60 ℃、壓力-0.1Mpa，20%乙醇濃度條件下，考察溶液體積從500 mL減壓濃縮至50 mL，分析減壓濃縮對(duì)迷迭香酸轉(zhuǎn)移率的影響。

1.3.10 納濾膜耐用性研究

根據(jù)優(yōu)選出的迷迭香酸納濾分離參數(shù)，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)分離，待循環(huán)溶液量達(dá)到5、10、20、50、100 L時(shí)，采用純化水清洗，計(jì)算膜通量，分析乙醇水溶液條件下的納濾膜耐用性。

2 結(jié)果與討論

2.1 迷迭香酸濃度對(duì)納濾分離的影響

從圖1中迷迭香酸截留率曲線變化可以看出，在20%乙醇水溶液環(huán)境中，隨著溶質(zhì)濃度和納濾膜截留分子量的升高，迷迭香酸截留率均表現(xiàn)出下降的，此結(jié)果符合納濾分離原理中的分子切割和溶解-擴(kuò)散效應(yīng)[13,14]，提示低濃度和低截留率分子量有利于提升溶質(zhì)分子的截留率。針對(duì)圖1結(jié)果和實(shí)際色

圖1 迷迭香酸濃度對(duì)截留率的影響Fig.1 Effect of concentration on the rejection of rosmarinic acid

譜制備過程中的迷迭香酸的濃度，對(duì)0.15～1.50 mg/mL濃度范圍進(jìn)行下一步考察。

2.2 乙醇濃度與膜通量的相關(guān)性

分析圖2可以得出，隨著乙醇濃度的升高，膜通量呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，其中以截留分子量800 Da的納濾膜最為明顯，這主要是因?yàn)殡S著水溶液中乙醇濃度逐步升高，在0%至40%范圍內(nèi)，溶液黏度逐步增加，而黏度與溶液擴(kuò)散系數(shù)呈負(fù)相關(guān)，因此隨著乙醇濃度的升高，溶液在納濾膜表面的溶劑擴(kuò)散系數(shù)下降，從而出現(xiàn)通量下降的結(jié)果[15,16]。同時(shí)，乙醇對(duì)膜材質(zhì)有一定的溶脹作用，引起膜孔徑縮小，也對(duì)膜通量具有一定的影響。

圖2 乙醇濃度對(duì)膜通量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the membrane flux

2.3 乙醇濃度對(duì)迷迭香酸截留率的影響

從圖3可知，乙醇濃度對(duì)截留分子量150 Da的納濾膜分離行為影響不明顯。隨著乙醇濃度升高至40%，迷迭香酸在800 Da的納濾膜中截留率從20.8%升高至95.6%?？紤]到乙醇對(duì)膜材質(zhì)溶脹損傷，并結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，對(duì)5%～30%乙醇濃度范圍進(jìn)行下一步考察?；谀そ亓舴肿恿亢鸵掖紳舛缺葘?duì)迷迭香酸截留行為的交互影響，實(shí)際制備得到的迷迭香酸濃度的不確定性，選擇響應(yīng)面法對(duì)迷迭香酸的分離行為進(jìn)行優(yōu)化研究，為實(shí)際生產(chǎn)中納濾濃縮參數(shù)的選擇提供依據(jù)。

圖3 乙醇濃度對(duì)迷迭香酸截留率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the rejection of rosmarinic acid

2.4 響應(yīng)面法分析優(yōu)化納濾分離參數(shù)

為進(jìn)一步優(yōu)化納濾富集迷迭香酸中間體，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選取乙醇濃度、溶質(zhì)濃度和截留分子量3個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，研究三因素不同組合對(duì)迷迭香酸截留率的影響。納濾操作以迷迭香酸在納濾膜中的吸附-解吸附達(dá)到平衡后，取樣分析，平行操作3次，截留率取平均值。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.1 模型方程建立與顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 8.06軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到迷迭香酸截留率對(duì)以上3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型：

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果

迷迭香酸截留率Y-91.73+5.99A-2.94B-8.34C+0.99AB+5.37AC-2.09BC-0.78A2+0.6B2-7.71C2。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3?；貧wF值為58.55，多元相關(guān)系數(shù)R2=0.986 9，預(yù)測(cè)R2=0.826 8，調(diào)整R2=0.970 0，說明模型對(duì)試驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好，試驗(yàn)誤差小。迷迭香酸納濾分離模型的P<0.0001，表明回歸模型極顯著，可用來進(jìn)行響應(yīng)值的預(yù)測(cè)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案正確。

由表4回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，迷迭香酸納濾分離模型的一次項(xiàng)(A、B、C)、二次項(xiàng)(C)及交互項(xiàng)(AC、BC)均表現(xiàn)出顯著性(P<0.01)或較顯著性(P<0.05)。表明各影響因素對(duì)于迷迭香酸截留率的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表4 響應(yīng)曲面二次回歸模型的方差分析

注：**P<0.01顯著；*P<0.05較顯著。

Note:**P<0.01 highly significant;*P<0.05 significant.

2.4.2 響應(yīng)曲面分析及條件優(yōu)化

多元回歸方程式所做的響應(yīng)曲面圖，見圖4。所考察因素對(duì)迷迭香酸截留率均有不同程度的影響，其中截留分子量影響顯著，隨著納濾膜孔徑的減小，根據(jù)孔徑篩分效應(yīng)其截留效果呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。乙醇濃度對(duì)迷迭香酸截留率影響顯著，曲面斜率大，隨著乙醇濃度的增加，迷迭香酸截留率升高，根據(jù)納濾分離中的溶解-擴(kuò)散模型，因?yàn)殡S著乙醇濃度增加，溶液黏度引起的擴(kuò)散系數(shù)減小而導(dǎo)致迷迭香酸難以接近膜表面，而難以透過納濾膜。溶質(zhì)濃度降低其截留率在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)出升高的現(xiàn)象，主要是因?yàn)槊缘闼釘U(kuò)散系數(shù)逐漸減小，其截留率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。對(duì)于迷迭香酸截留率的影響，考察因素中乙醇濃度與截留分子量交互作用顯著，在迷迭香酸濃度固定的條件下，隨著乙醇濃度升高或截留分子量的降低，截留率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

圖4 各因素交互作用對(duì)迷迭香酸得率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of factors on the extraction yield of rosmarinic acid

2.5 納濾分離優(yōu)化及減壓濃縮對(duì)比分析

由Design-Expert軟件優(yōu)化分析，結(jié)合迷迭香酸中間體制備時(shí)所涉及的乙醇濃度，以及納濾分離效率，優(yōu)選出的納濾分離參數(shù)為：溶質(zhì)濃度0.41 mg/mL，乙醇濃度20.63%，截留分子量450 Da，理論計(jì)算迷迭香酸截留率為95.00%。為了驗(yàn)證回歸模型的有效性，根據(jù)擬合的最佳工藝參數(shù)和試劑操作的可行性，調(diào)整為溶質(zhì)濃度0.41 mg/mL，乙醇濃度20.00%，截留分子量450 Da條件下進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)并與減壓濃縮工藝進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表5。在迷迭香酸保留方面，納濾高于傳統(tǒng)的減壓濃縮，傳統(tǒng)的減壓濃縮由于乙醇含量較低，效率低下。在對(duì)比試驗(yàn)開展過程中發(fā)現(xiàn)納濾分離周期遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于減壓濃縮，技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯。

表5 濃縮工藝對(duì)比

2.6 納濾膜耐用性

隨著納濾膜使用周期的延長(zhǎng)，膜通量呈現(xiàn)出衰減的現(xiàn)象，從圖5可以看出，在20%乙醇溶液環(huán)境中，當(dāng)循環(huán)體積低于10 L時(shí)，通過純化水清洗，可以抑制因有機(jī)溶劑浸泡而導(dǎo)致納濾膜材質(zhì)溶脹，或溶液引起的膜孔堵塞污染，而保持納濾膜通量。當(dāng)循環(huán)藥液體積量增加并長(zhǎng)周期使用，純化水清洗效果下降，可能是由膜材質(zhì)溶質(zhì)的不可逆性或膜污染的清洗效率降低引起的。此結(jié)果提示，在納濾膜在有機(jī)溶液環(huán)境下使用時(shí)，應(yīng)注意使用周期及清洗方法，方能保障膜通量、降低膜污染。在膜通量逐漸衰減的同時(shí)，迷迭香酸截留率并未發(fā)生明顯變化，提示納濾膜組件分離性能的耐用性較好。

圖5 循環(huán)體積對(duì)膜通量衰減和溶質(zhì)截留率的影響Fig.5 Effect of circulating volume on the membrane flux and rejection

3 結(jié)論

基于膜分離技術(shù)考察迷迭香酸中間體富集方法，分析在低濃度乙醇溶液環(huán)境中迷迭香酸的納濾膜分離傳質(zhì)行為，低濃度乙醇溶液黏度高于水溶液，引起迷迭香酸擴(kuò)散系數(shù)降低，而不容易進(jìn)入納濾膜表面而提高截留率。在提高分離效率保障截留率的前提下，優(yōu)化出的納濾分離參數(shù)為溶質(zhì)濃度0.41 mg/mL，乙醇濃度20.00%，截留分子量450 Da，迷迭香酸實(shí)際截留率高于93%，且可以根據(jù)溶質(zhì)濃度及乙醇濃度，通過建立的模型方程進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，方法具有較強(qiáng)的適用性。

食品、藥品原料的制備因熱處理導(dǎo)致成分分解轉(zhuǎn)化的技術(shù)瓶頸，通過建立模型完成工藝優(yōu)選[17]，在一定程度上可以通過納濾分離技術(shù)予以替換，尤其是含有低濃度乙醇的溶液環(huán)境下。迷迭香酸熱穩(wěn)定性差，通過納濾常溫富集可以提升其濃度數(shù)十倍以上，并不造成成分損失，且生產(chǎn)周期較減壓濃縮短，技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯。以此方法制備的迷迭香酸進(jìn)而與冷凍干燥等技術(shù)制備的原料，將可以較好的保留其抗氧化活性，降低其在食品、化妝品和藥品中的使用成本。