羅伊氏乳桿菌發(fā)酵對(duì)酸乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響

溫夏萍，王呈，弓耀忠

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，太原 030032； 2.山西省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，太原 030012）

隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高，在飲食消費(fèi)方面，消費(fèi)者更加注重選擇既營(yíng)養(yǎng)又健康的食品。發(fā)酵乳以其豐富的營(yíng)養(yǎng)和多樣的功能性越來(lái)越受到人們關(guān)注。發(fā)酵乳是益生菌理想的載體，益生菌在發(fā)酵乳中使用日益普遍，其產(chǎn)品比重不斷擴(kuò)大。羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）是目前已報(bào)道的所有脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)天然存在的乳酸菌之一[1]。我國(guó)衛(wèi)生部于2003年批準(zhǔn)了羅伊氏乳桿菌可作為人類(lèi)保健品的微生物菌種，且該菌是國(guó)際上公認(rèn)的新型益生乳酸菌，具有很高的理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值[2]。

在牛乳中，羅伊氏乳桿菌單種發(fā)酵能力較弱，因而本課題采用混菌發(fā)酵方式，探討羅伊氏乳桿菌的發(fā)酵作用對(duì)牛乳營(yíng)養(yǎng)成分的影響，為羅伊氏乳桿菌的應(yīng)用及羅伊氏乳桿菌牛乳發(fā)酵制品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

所選取的乳酸菌羅伊氏乳桿菌（Lactobacillusr e u t e r i）L A-0 2、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）LD-02、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）LS-11均由本實(shí)驗(yàn)室分離、選育和保存。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）ATCC 7469由本實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)和保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

脫脂乳培養(yǎng)基：取牛場(chǎng)新鮮無(wú)抗牛乳脫脂后，加入1%自制營(yíng)養(yǎng)添加劑，分裝于50mL玻璃瓶中，無(wú)氧條件下硅膠塞密封后，115℃、15min滅菌備用。

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

生物潔清工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海成光儀器有限公司；熒光光度計(jì)，北京吉天儀器有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；多功能紅外爐，廣東美的生活電器制造有限公司；電動(dòng)乳脂分離機(jī)，青海農(nóng)牧機(jī)械制造有限公司；渦旋振蕩器，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化

從-80℃取出菌株復(fù)蘇純化，LA-02、LD-02培養(yǎng)溫度37℃，LS-11培養(yǎng)溫度40℃；將其在MRS肉湯培養(yǎng)基分別活化培養(yǎng)三代；將LA-02、LD-02和LS-11分別按1%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18h，作為菌種備用，使用時(shí)搖勻。

1.2.2 接種及發(fā)酵條件

將制備好的脫脂乳培養(yǎng)基分成兩組。厭氧條件下，A組接入0.5% LA-02、0.5% LD-02和0.5% LS-11；B組接入0.75% LD-02和0.75% LS-11。將兩組同時(shí)置于37℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為脫脂乳培養(yǎng)基凝固終止發(fā)酵。

1.2.3 活菌計(jì)數(shù)

從培養(yǎng)0時(shí)起，每隔1h取A、B組發(fā)酵液各一瓶分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。厭氧條件下，取發(fā)酵液1mL進(jìn)行適度稀釋，用滅菌的玻璃涂布棒將稀釋好的發(fā)酵液100μL，涂布于MRS培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)48h，計(jì)算活菌數(shù)（cfu/mL） ?；罹?jì)數(shù)具體方法及數(shù)據(jù)處理參照國(guó)標(biāo)GB4789.35—2010。

1.2.4 酸度的測(cè)定

從培養(yǎng)0時(shí)起，每隔1h取A、B組發(fā)酵液各一瓶分別進(jìn)行酸度測(cè)定。厭菌條件下取10mL發(fā)酵液，加入20mL蒸餾水，搖勻后加入2～3滴酚酞指示劑，用0.1mol/L NaOH滴定樣品呈粉紅色且30s不褪色，讀出所用的NaOH體積數(shù)，乘以10即為樣品的滴定酸度值（°T）。

1.2.5 游離氨基酸含量的測(cè)定

樣品前處理：取樣品乳5mL置于50mL容量瓶中，加入2mL乙酸鋅溶液和2mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，定容至刻度，靜置沉淀后，過(guò)濾，棄去最初少量濾液，濾液備用[3]。游離氨基酸含量的測(cè)定，參照GB/T 8314—2013的方法進(jìn)行。

1.2.6 硫胺素、核黃素及葉酸含量：分別參照國(guó)標(biāo) GB5009.84-2016[4]、 GB5009.85-2016[5]、GB5009.211-2014[6]中相關(guān)方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 活菌總數(shù)變化

本項(xiàng)試驗(yàn)測(cè)定A、B兩組活菌總數(shù)的變化。通過(guò)比較進(jìn)一步了解羅伊氏乳桿菌在牛乳中的生長(zhǎng)狀態(tài)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

表1 牛乳發(fā)酵過(guò)程中活菌總數(shù)的變化

圖1 牛乳發(fā)酵過(guò)程中活菌總數(shù)的變化

從圖1可看出，與B組相比，含有羅伊氏乳桿菌LA-02的A組生長(zhǎng)較為旺盛，活菌總數(shù)最高達(dá)到1.75×109，發(fā)酵9h時(shí)A組活菌數(shù)與B組相差最大，達(dá)到5.9×108個(gè)。

2.2 酸度變化

本項(xiàng)試驗(yàn)測(cè)定A、B兩組酸度的變化。通過(guò)比較進(jìn)一步了解羅伊氏乳桿菌在牛乳中的生長(zhǎng)狀態(tài)，并了解其在牛乳中的產(chǎn)酸能力。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。

表2 牛乳發(fā)酵過(guò)程中的酸度變化

圖2 牛乳發(fā)酵過(guò)程中的酸度變化

從圖2可看出，A組與B組酸度曲線約在5.5h發(fā)生交叉，0～5.5h階段，A組的酸度要高于B組；5.5～9h階段，B組的酸度要高于A組。培養(yǎng)9h乳凝固發(fā)酵終止時(shí)，B組的酸度達(dá)到93.9°T，而A組的酸度只有85.7°T 。

2.3 牛乳發(fā)酵前后游離氨基酸總量和硫胺素、核黃素、葉酸含量的變化

表3 牛乳發(fā)酵前后游離氨基酸總量和硫胺素、核黃素、葉酸含量的變化

圖3 牛乳發(fā)酵前后游離氨基酸總量和硫胺素、核黃素、葉酸含量的變化

從表3、圖3可知，總體上看脫脂乳培養(yǎng)基經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后其游離氨基酸總量和硫胺素、核黃素、葉酸含量均有不同程度的提高，只是由于發(fā)酵菌種的不同，增加幅度不同。從組間比較分析可看出，游離氨基酸和核黃素增加幅度A組要明顯高于B組，而兩組間硫胺素和葉酸增加幅度差別不明顯。

3 討論

在混菌發(fā)酵體系中，生長(zhǎng)曲線可反映整個(gè)體系微生物在培養(yǎng)介質(zhì)中的生長(zhǎng)狀態(tài)。對(duì)圖1分析可得到以下結(jié)論：在脫脂乳培養(yǎng)基中，A組混菌發(fā)酵體系的生長(zhǎng)狀態(tài)要優(yōu)于B組；與B組相比，A組中多了羅伊氏乳桿菌LA-02，也就是說(shuō)，羅伊氏乳桿菌LA-02的接入可改善LD-02和LS-11混菌發(fā)酵體系在脫脂乳培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)。

酸度變化曲線可反映發(fā)酵體系的產(chǎn)酸能力，也可印證其在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)。對(duì)圖2分析可將酸度變化分成兩個(gè)階段，培養(yǎng)0～5.5h為第一階段，培養(yǎng)5.5h至結(jié)束為第二階段。第一階段A組的酸度要高于B組，這與圖1的結(jié)果相一致。第二階段酸度變化發(fā)生了反轉(zhuǎn)，B組高于A組。究其原因，主要是羅伊氏乳桿菌LA-02產(chǎn)酸特性所確定的。LA-02發(fā)酵乳糖主要產(chǎn)生乳酸、碳酸和乙酸，碳酸不穩(wěn)定易分解成二氧化碳揮發(fā)，致使培養(yǎng)基酸度增長(zhǎng)速度降低。

有資料顯示，酸乳中的游離氨基酸量主要取決于發(fā)酵菌株的乳蛋白水解能力[7]；酸乳中硫胺素和核黃素提高量與發(fā)酵劑組分成正相關(guān)[8]。因而，對(duì)圖3分析可得出：在菌株LD-02、LS-11組成的發(fā)酵劑中，加入LA-02能明顯提高發(fā)酵乳核黃素的含量。