牛結(jié)核γ-干擾素檢測法和比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)在牛臨床檢測中應(yīng)用

楊莉，劉心，彭清潔，李慶妮，陳穎鈺,,4,5，胡長敏，陳曦，李翔，郭愛珍,,4,5

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；3.武漢科前生物股份有限公司，武漢 430070；4.國家動(dòng)物結(jié)核病專業(yè)實(shí)驗(yàn)室（武漢），武漢 430070；5.湖北省動(dòng)物流行病學(xué)國際科技合作基地，武漢 430070；6.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢 430070)

牛結(jié)核病（bovinetuberculosis,bTB）是一種由牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis，M.bovis）引起的慢性消耗性人獸共患傳染病，給養(yǎng)牛業(yè)、食品安全和公共衛(wèi)生帶來及其嚴(yán)重的危害[1]。牛結(jié)核病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定必須通報(bào)的疾病之一，在我國列為二類動(dòng)物疫病。在《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》中，奶牛結(jié)核病被列為國內(nèi)優(yōu)先控制和根除的16種重大疫病之一。由于牛結(jié)核病控制存在潛伏感染率高、發(fā)病慢、發(fā)病和治愈難以及疫苗保護(hù)均缺少有效的判斷標(biāo)準(zhǔn)等實(shí)際問題，牛結(jié)核成為了唯一不打疫苗、不進(jìn)行治療、完全依靠“檢測+撲殺”控制的重要疫病，因此，準(zhǔn)確、快速、簡便、價(jià)廉的檢測方法是國內(nèi)外控制牛結(jié)核的最大技術(shù)需求。

在發(fā)達(dá)國家或地區(qū)，每年牛分枝桿菌導(dǎo)致人結(jié)核病比例為1%左右，但在發(fā)展中國家或貧困地區(qū)該比例可達(dá)5%～28%[2]。世界衛(wèi)生組織（WHO）提出2035年消滅人結(jié)核，凈化牛結(jié)核是消滅人結(jié)核的前提之一。我國是全球人和牛結(jié)核病的高負(fù)擔(dān)國家，牛結(jié)核病控制和凈化已迫在眉睫。

當(dāng)前國內(nèi)主要的檢疫方法為結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（GB/T 18645-2002），包括結(jié)核菌素單皮試法（SCT）和結(jié)核菌素比較皮試法（CCT）。SCT法檢測成本低、靈敏度高，但極易因環(huán)境分枝桿菌的感染而出現(xiàn)非特異性結(jié)果，導(dǎo)致假陽性。因此越來越多的國家采用了CCT法進(jìn)行檢測，雖然提高了成本，但能夠在一定程度上降低由環(huán)境分枝桿菌所導(dǎo)致的干擾。但即便如此，尤其是在高流行率國家，CCT仍會(huì)導(dǎo)致大量的假陽性結(jié)果。

牛結(jié)核檢測法又稱γ-干擾素體外釋放檢測法，是國際公認(rèn)的牛結(jié)核確診標(biāo)準(zhǔn)[3]，目前也被列為我國國家標(biāo)準(zhǔn)（國標(biāo)GB/T 32945-2016），和牛結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)相比具有更高的特異性，在歐美發(fā)達(dá)國家被廣泛用于牛結(jié)核病的控制和凈化。澳大利亞率先研發(fā)出牛結(jié)核IFN-γ體外釋放檢測法[4]，澳大利亞政府1991年批準(zhǔn)該方法為牛結(jié)核檢測官方使用方法。隨后（1990s’后期），新西蘭也將該方法確定為牛結(jié)核官方檢測方法；其他國家如埃塞俄比亞、英國、北愛爾蘭、意大利、西班牙、美國、加拿大等也已批準(zhǔn)該方法為牛結(jié)核檢測官方檢測方法[5]。進(jìn)口試劑盒價(jià)格昂貴，不適合我國國情[6]。我國研究人員已研發(fā)并注冊(cè)了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的檢測試劑盒，在保證檢測效果的基礎(chǔ)上，顯著降低了檢測成本。

我國作為牛結(jié)核病高流行率國家，“殺不起”是我國目前的普遍現(xiàn)狀，找到適合我國國情的牛結(jié)核檢測方案是控制牛結(jié)核病關(guān)鍵。因此，本研究通過平行使用不同方法進(jìn)行牛結(jié)核檢測和比較分析，旨在指導(dǎo)臨床制定合理的檢測程序，有效選擇和應(yīng)用牛結(jié)核檢測方法，進(jìn)行牛結(jié)核控制和凈化。

1 材料與方法

1.1 材料

選取某牛結(jié)核病高流行場群作為研究對(duì)象。隨機(jī)選取其中200頭成母牛同時(shí)進(jìn)行比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)以及γ-干擾素檢測法的檢測。

本研究所采用牛結(jié)核病γ-干擾素檢測試劑盒（（2019）新獸藥證字7號(hào)）由武漢科前生物股份有限公司生產(chǎn)（以下簡稱KIT1）。商品化的牛結(jié)核病診斷γ-干擾素檢測試劑盒（KIT2）Bovigam?購自廣州市瑞品生物技術(shù)有限公司，為瑞士Prionics公司產(chǎn)品。

牛型提純結(jié)核菌素和禽型提純結(jié)核菌素購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

結(jié)核菌素比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)按《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)GB/T 18645-2002》規(guī)定操作進(jìn)行試驗(yàn)，在同側(cè)頸部相距15cm處，分別量取皮皺厚，注射牛結(jié)核菌素（2000IU/0.1mL）和禽結(jié)核菌素（2500 IU/0.1mL），72h后，觀察注射部位炎性反應(yīng)，并量取皮皺厚，根據(jù)皮皺厚增加值判斷結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)參照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織的規(guī)定，具體為：對(duì)牛型結(jié)核分枝桿菌PPD的反應(yīng)大于對(duì)禽型結(jié)核分枝桿菌PPD的反應(yīng)，二者皮皺厚增加值的差異≥4.0mm，判為牛結(jié)核陽性；1.0～4.0mm判為可疑；≤0mm判為陰性。

牛結(jié)核γ-干擾素檢測法均依照各自說明書進(jìn)行?；境绦蚴牵簾o菌采集血液5～10mL，迅速置于含肝素鈉的抗凝管中，輕輕顛倒混勻，室溫條件下36h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，按照產(chǎn)品說明書分別進(jìn)行牛結(jié)核菌素和禽結(jié)核菌素刺激培養(yǎng)和γ-干擾素檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測流行率的比較分析

對(duì)200頭奶牛進(jìn)行三種方法的檢測比較，結(jié)果如表1所示。CCT的檢測流行率最高，為51%(102/200)(95%CI，19.6-32.1)。KIT1的檢測流行率最低，為24%(48/200)(95%CI，18.3-30.5)。KIT2居中，為27%(54/200)(95% CI，21.0-33.7)。KIT1和KIT2試劑盒的檢測流行率無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 CCT與KIT1方法的評(píng)估

鑒于KIT2檢測試劑盒為目前已使用的檢測方法，故以KIT2的檢測結(jié)果作為參考方法，進(jìn)行不同方法的比較。

依照表2所示結(jié)果，在146頭KIT2檢測陰性動(dòng)物中，CCT檢測為陽性的頭數(shù)為49頭；KIT2檢測出54頭陽性中，1頭CCT檢測為陰性。根據(jù)檢測結(jié)果，測算KIT2與CCT法兩者陽性符合率為68.0% (95% CI∶56.4,78.1)，陰性符合率為79.5% (95% CI∶ 71.3, 86.3)，總符合率為75.0% (95% CI∶ 68.4, 80.8)，kappa值為0.50(95% CI, 40.0-61.0)。具有中等一致性。若以KIT2作為診斷的標(biāo)準(zhǔn)，測算CCT的陽性預(yù)測值為54.0%(95% CI∶41.8, 62.0)，即在所有檢測陽性動(dòng)物中，僅有54.0%的動(dòng)物為真陽性動(dòng)物，46%的為假陽性；陰性預(yù)測值為99.0%(95% CI∶94.4, 100.0)，即在所有檢測陰性動(dòng)物中，99.0%的動(dòng)物為真陰性。依據(jù)我國相關(guān)規(guī)定，對(duì)檢測陽性牛必須進(jìn)行撲殺，以平均每頭奶牛價(jià)格10000元計(jì)算，由于錯(cuò)殺所導(dǎo)致的直接經(jīng)濟(jì)損失為49頭×10000元/頭=490 000元。

將KIT1與KIT2進(jìn)行比較，結(jié)果顯示（表2），在54頭KIT2檢測陽性牛中，8頭KIT1檢測為陰性；146頭KIT2檢測陰性牛中，2頭KIT1檢測為陽性。兩種方法陽性符合率為90.2% (95% CI∶78.6,96.7)，陰性符合率為96.6% (95% CI∶92.3, 98.9)。總符合率為95.0% (95%CI∶91.0, 97.6)， kappa值為0.87(95% CI, 79.0-95.0)，具有較好的一致性。同理，若以KIT2作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，則KIT1陽性預(yù)測值為95.8% (95% CI∶85.7, 99.5)；陰性預(yù)測值為94.7% (95% CI∶ 89.9, 97.7)。以平均奶牛價(jià)格10000元計(jì)算，由于錯(cuò)殺所導(dǎo)致的直接經(jīng)濟(jì)損失為2頭×10000元/頭=20,000元。顯著低于CCT所導(dǎo)致的錯(cuò)殺損失，兩者差異極其顯著。但由于目前牛結(jié)核病缺乏診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，因此無法比較KIT1與KIT2的優(yōu)劣，僅能夠通過兩者的一致性，確定KIT1能夠作為KIT2的替代產(chǎn)品。

基于以上結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：CCT敏感性較高但特異性較差，易造成假陽性結(jié)果，導(dǎo)致錯(cuò)殺；KIT1法敏感性相對(duì)于CCT法較低但特異性高，與KIT2有很好的一致性，完全可以作為KIT2方法的替代，既節(jié)約了成本，又能夠保證檢測的準(zhǔn)確性。

表2 CCT、KIT1與KIT2的檢測結(jié)果

2.3 系列檢測的準(zhǔn)確性評(píng)估

在實(shí)際臨床應(yīng)用中，雖然KIT1成本顯著低于KIT2成本，但仍高于CCT方法許多，為進(jìn)一步降低成本，我們采用CCT與KIT1兩種方法聯(lián)合使用的策略，對(duì)其準(zhǔn)確性進(jìn)行了評(píng)估測算（表3）。在CCT所檢測出來的102頭陽性奶牛中，KIT1檢測為陽性的有47頭（46.0%），陰性的55頭（53.9%）。在CCT檢測出來的98頭陰性奶牛中，97頭用KIT1方法檢測也為陰性（98.9%），僅1頭KIT1檢出為陽性（1.0%）。以上數(shù)據(jù)結(jié)合以KIT2為對(duì)照所測算的CCT陰性預(yù)測值，可以確定的是CCT對(duì)陰性動(dòng)物有著極高的預(yù)測能力（99.0%的動(dòng)物為真陰性），因此對(duì)CCT所檢測出來的陰性樣本可以視作是真陰性，作為陰性群體進(jìn)行隔離飼養(yǎng)。而對(duì)其檢測出來的陽性樣本，由于其預(yù)測真陽性能力有限，可以采用陽性預(yù)測值高的KIT1方法（95.8%）對(duì)該部分樣品進(jìn)行復(fù)篩（診斷），在本研究的102頭CCT檢測陽性動(dòng)物中，則可以減少53.9%的假陽性動(dòng)物檢測。極大地降低了錯(cuò)殺而導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。是一種符合高流行率場群的檢測策略。

表3 CCT 與KIT1方法比較結(jié)果

3 討論

對(duì)于牛結(jié)核病檢測方面，國際公認(rèn)的確診方法為γ-干擾素體外釋放法，商品化Bovigam?試劑盒（KIT2）是目前國際普遍使用的產(chǎn)品。因此本研究將其作為參考方法進(jìn)行對(duì)照研究。皮試是OIE以及國標(biāo)推薦的檢測方法。傳統(tǒng)單一皮試特異性太差，因此在本研究中，采用比較皮試法進(jìn)行了檢測依照本研究結(jié)果，CCT在進(jìn)行檢測時(shí)，其檢測陽性動(dòng)物中僅有46%的真陽性預(yù)測能力，故由于錯(cuò)殺導(dǎo)致極大的經(jīng)濟(jì)損失。我國牛結(jié)核病呈流行態(tài)勢(shì)，各地流行情況不一。在1985、1987年進(jìn)行的2次全國奶牛抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，牛結(jié)核病的患病率分別為5.83%與5.43%，2001年對(duì)26個(gè)省市的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，個(gè)別省份患病率高達(dá)10.18%；2002年患病率超過1%的有10個(gè)省，個(gè)別省高達(dá)7%[7]。對(duì)我國北方某地區(qū)33個(gè)奶牛場的牛結(jié)核病學(xué)調(diào)查顯示，個(gè)體陽性率高達(dá)13.99%，群陽性率為51.51%[8]。因此在這些高流行率場群或地區(qū)，僅由CCT進(jìn)行檢測會(huì)導(dǎo)致極大的經(jīng)濟(jì)損失。在那些僅使用傳統(tǒng)單皮試法進(jìn)行檢測的場群，所導(dǎo)致的錯(cuò)殺更是不可估量。

γ-干擾素方法是公認(rèn)敏感性、特異性均較高的方法，但現(xiàn)有進(jìn)口檢測試劑盒價(jià)格十分昂貴，每頭檢測費(fèi)用約合人民幣150元，實(shí)際應(yīng)用中很多農(nóng)戶表明難以承受，因此不適合于我國的國情。KIT1為具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)產(chǎn)品，雖目前未商品化上市，但初步測算成本將顯著低于KIT2。依據(jù)本研究所得出的結(jié)果，KIT1方法與KIT2方法一致性非常高（Kappa值為0.87），完全可以作為KIT2方法的替代，既節(jié)約了成本，又能夠保證檢測的準(zhǔn)確性。

對(duì)于高流行率群體，在進(jìn)行牛結(jié)核病防控時(shí)，當(dāng)務(wù)之急并不是根除，而是控制，即降低流行率。如何讓農(nóng)戶積極配合，在他們可接受的范圍內(nèi)準(zhǔn)確檢測出陽性動(dòng)物并進(jìn)行撲殺十分關(guān)鍵。從某種意義而言，“不錯(cuò)殺”，相較“不漏殺”更能夠讓農(nóng)戶接受。CCT方法具有非常高的陰性預(yù)測值，因此對(duì)陰性動(dòng)物具有很高的預(yù)測能力。但其敏感性過高，導(dǎo)致假陽性率高，淘汰成本大，會(huì)導(dǎo)致農(nóng)戶的積極排斥和不配合。綜合考慮流行狀況及成本效益，建議采用SCT或CCT進(jìn)行初篩后，對(duì)檢測陽性動(dòng)物利用KIT1方法進(jìn)行確診。以本研究所采用牛場為例進(jìn)行測算，200頭份成母牛檢測，采用CCT進(jìn)行檢測成本為200頭×10元/頭=2000元；對(duì)其檢測出來的102份陽性動(dòng)物再進(jìn)行KIT1的復(fù)篩，以每頭檢測成本50元測算，則需要102頭×50元/頭=5100元，合計(jì)共需7100元。既使全部使用KIT1，所需成本為（200×50=10 000元），與KIT2所需成本（200×150=30 000元）相比也僅是KIT2成本花費(fèi)的三分之一，而又能保證檢測的準(zhǔn)確性，是一種非常實(shí)用的防控策略。

在確定了有效檢測方法外，還應(yīng)采用科學(xué)合理的檢測頻率。檢測頻率由流行率水平、所能承擔(dān)的檢測成本和檢測能力等因素決定，可確定每3月、每6月等檢測一次。如果陽性率已降至很低水平如0.1%，可將檢測間隔延長至一年一次。

不僅如此，在嚴(yán)格實(shí)行科學(xué)合理的檢測程序和及時(shí)淘汰陽性牛外，還應(yīng)建立嚴(yán)格和完善的生物安全體系。引種牛的隔離檢測是其中最重要的環(huán)節(jié)。新引入牛應(yīng)隔離30～45天，到達(dá)和隔離結(jié)束前進(jìn)行兩次檢測，全部陰性后方可并群。

4 結(jié)論

牛結(jié)核IFN-γ檢測方法符合臨床牛結(jié)核病控制的確診檢測，在成本控制的牛場，可用皮試法初篩，其陽性牛用牛結(jié)核病IFN-γ檢測法確診。同時(shí)，必須配套合適的檢測頻率和生物安全措施才能有效控制和凈化牛結(jié)核病。