亞硝態(tài)氮對(duì)中華鳑鲏的急性毒性及短期影響

封 琦，胡春風(fēng)，洪奧博，薛 松，嵇 元，王 權(quán)

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 水產(chǎn)科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300 )

亞硝態(tài)氮作為氮循環(huán)中氨態(tài)氮向硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物，廣泛存在于水生態(tài)系統(tǒng)中。相對(duì)于陸生動(dòng)物，魚類受亞硝態(tài)氮影響較大，這是因?yàn)轸~鰓上皮細(xì)胞可以自周圍水體中主動(dòng)吸收亞硝態(tài)氮，并累積在體液中。亞硝態(tài)氮主要影響魚體的離子調(diào)節(jié)、呼吸、心血管、內(nèi)分泌以及排泄功能[1]。精養(yǎng)體系(主要是水體交換量很少的靜水和循環(huán)水模式)中，亞硝態(tài)氮的累積會(huì)對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象產(chǎn)生應(yīng)激作用，造成生長(zhǎng)緩慢乃至大量死亡[2-5]。

中華鳑鲏(Rhodeussinensis)是我國(guó)(除黑龍江水系外)廣泛分布的淡水魚類，本身具有較高的觀賞價(jià)值[6]，同時(shí)可以與其他水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物混養(yǎng)以提高經(jīng)濟(jì)效益[7-10]，而且可對(duì)養(yǎng)殖水體環(huán)境變化進(jìn)行生物預(yù)警[11-13]。筆者以中華鳑鲏為研究對(duì)象，對(duì)亞硝態(tài)氮急性毒性及短期脅迫條件下，中華鳑鲏血清中過氧化氫酶和堿性磷酸酶的活性變化進(jìn)行研究，旨在為中華鳑鲏生態(tài)套養(yǎng)模式中的水質(zhì)管理提供科學(xué)建議。

1 材料與方法

1.1 材料

中華鳑鲏取自江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院水產(chǎn)實(shí)訓(xùn)中心，試驗(yàn)前暫養(yǎng)于1.0 m×0.6 m×0.5 m的水族缸中兩周。試驗(yàn)期間，正常投喂配合飼料，每日虹吸清除底部殘?jiān)?，水?25±1) ℃，pH 7.4±0.1，溶解氧(6.3±0.6) mg/L。挑選健康、活躍個(gè)體[體質(zhì)量(0.636±0.09) g，體長(zhǎng)(3.9±0.39) cm]用于試驗(yàn)。

過氧化氫酶測(cè)定試劑盒、堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，NaNO2為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用靜水法進(jìn)行急性毒性測(cè)試，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置6個(gè)質(zhì)量濃度組(6、10、11、14、16.6、18 mg/L)和1個(gè)空白對(duì)照組，每組3個(gè)平行。不同質(zhì)量濃度的測(cè)試液均采用超純水(pH約7.4)添加適量NaNO2制備而成，每組水量10 L。每個(gè)質(zhì)量濃度組隨機(jī)加入20尾活力良好的中華鳑鲏，24 h后計(jì)數(shù)死亡個(gè)體數(shù)。

根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置高、中、低3個(gè)處理組，分別為24 h 半致死質(zhì)量濃度的1/10、1/20、1/30，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行，保持試驗(yàn)期間水中亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度穩(wěn)定；在0(試驗(yàn)開始前)、24、48、72 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各隨機(jī)取出5尾，采用1 mL無菌注射器圍心腔取血，合并置于無菌離心管中，3500 r/min離心10 min, 取上層血清，立即測(cè)定過氧化氫酶、堿性磷酸酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

急性毒性數(shù)據(jù)采用概率單位法分析；對(duì)酶活性數(shù)據(jù)先進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)和Levene′s方差齊性檢驗(yàn)；當(dāng)上述條件均滿足后，采用雙因素方差分析因子主效應(yīng)(固定因子為亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度和暴露時(shí)間)，對(duì)交互作用進(jìn)行簡(jiǎn)單效應(yīng)分析[14]；若未滿足上述參數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)條件(數(shù)據(jù)正態(tài)性和方差齊性)，則先進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換[15]；若實(shí)在無法滿足參數(shù)統(tǒng)計(jì)條件(數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后，仍無法滿足上述參數(shù)檢驗(yàn)條件)，則運(yùn)用Dunnett′s C非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，所有計(jì)算均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 24.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝態(tài)氮對(duì)中華鳑鲏的急性毒性

試驗(yàn)中觀察到魚狂躁不安，出現(xiàn)體表充血、死亡現(xiàn)象。根據(jù)24 h急性毒性試驗(yàn)結(jié)果(表1)，計(jì)算得到亞硝態(tài)氮對(duì)中華鳑鲏24 h半致死質(zhì)量濃度為12.76 mg/L。

表1 亞硝態(tài)氮對(duì)中華鳑鲏的急性毒性效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

2.2 亞硝態(tài)氮對(duì)中華鳑鲏血清過氧化氫酶活性的影響

雙因素方差分析結(jié)果表明，亞硝態(tài)氮暴露時(shí)間對(duì)過氧化氫酶活性作用影響極顯著，并且亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度和暴露時(shí)間兩者間存在極顯著的交互作用。因亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度對(duì)過氧化氫酶活性作用影響不明顯，后期簡(jiǎn)單效應(yīng)分析僅檢測(cè)在不同亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度水平上的暴露時(shí)間效應(yīng)。3個(gè)質(zhì)量濃度組過氧化氫酶活性變化大致相同，隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在第48 h過氧化氫酶活性達(dá)到峰值(顯著高于各自對(duì)照組)，并且隨著亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度增加而升高(圖1)。

圖1 亞硝態(tài)氮對(duì)中華鳑鲏血清過氧化氫酶活性的影響圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05).下同.

2.3 亞硝態(tài)氮對(duì)中華鳑鲏血清堿性磷酸酶活性的影響

數(shù)據(jù)預(yù)處理發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶活性數(shù)據(jù)還缺方差齊性條件，對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后可以滿足參數(shù)統(tǒng)計(jì)條件，因此后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析中均采用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)。雙因素方差分析結(jié)果表明，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度和暴露時(shí)間均會(huì)對(duì)堿性磷酸酶活性造成極顯著的影響，并且兩因素之間存在極顯著的交互作用。3個(gè)質(zhì)量濃度組堿性磷酸酶活性在24 h均顯著下降，在48 h呈回升趨勢(shì)，此后在72 h再次明顯下降(圖2a)。在24 h堿性磷酸酶活性亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度升高呈顯著下降趨勢(shì)，在72 h 0.64、1.28 mg/L組酶活性均顯著低于0.43 mg/L組(圖2b)。

圖2 亞硝態(tài)氮對(duì)中華鳑鲏血清堿性磷酸酶活性的影響

3 討 論

3.1 亞硝態(tài)氮對(duì)中華鳑鲏的急性毒性

亞硝態(tài)氮含量超標(biāo)是集約化高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖常遇到的問題[16]。淡水魚類鰓部能夠通過與氯離子競(jìng)爭(zhēng)自外界環(huán)境中主動(dòng)吸收亞硝酸根離子，水環(huán)境中亞硝態(tài)氮的累積會(huì)對(duì)淡水魚類造成潛在危害。亞硝態(tài)氮在魚體內(nèi)累積的主要毒害作用是將血紅蛋白中的亞鐵離子氧化成高鐵離子，從而抑制或降低血液供氧能力[17-18]。

本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在水溫25 ℃、pH 7.4、溶解氧6.3 mg/L的條件下，亞硝態(tài)氮對(duì)中華鳑鲏的24 h半致死質(zhì)量濃度(12.76 mg/L)要低于此前報(bào)道的高體鳑鲏(R.ocellatus)魚苗(97.05 mg/L)[19]、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)(372.59 mg/L)[20]、鳙魚(Aristichthysnobilis)(411.20 mg/L)[20]、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)(201.88 mg/L)[21]、暗紋東方鲀(T.obscurus)(202 mg/L)[22]、麥穗魚(Pseudorasboraparva)(422.862 mg/L)[23]。亞硝態(tài)氮對(duì)水生生物的毒性受多種內(nèi)外因素共同作用，其中最重要的影響因子有水質(zhì)(包括pH、溫度、陽(yáng)離子、陰離子及溶解氧)、暴露時(shí)間、魚種及個(gè)體敏感性差異等[24-25]。試驗(yàn)所采用的溫度和pH條件參考了已有的研究報(bào)道，pH、水溫和溶解氧也符合淡水魚類正常生長(zhǎng)要求，排除了主要外在因素的干擾(氯離子和其他可能產(chǎn)生干擾的離子)，試驗(yàn)結(jié)果具有一定的可比性。結(jié)果表明，中華鳑鲏對(duì)亞硝態(tài)氮比較敏感。

3.2 亞硝態(tài)氮對(duì)過氧化氫酶活性的作用

亞硝態(tài)氮通過血液擴(kuò)散到紅細(xì)胞中發(fā)揮作用，血液是其在魚體中的主要靶位點(diǎn)[26-27]。已有報(bào)道表明亞硝態(tài)氮會(huì)誘發(fā)水生動(dòng)物產(chǎn)生氧化應(yīng)激[2,28]。因此本次試驗(yàn)以血清為樣本，對(duì)其抗氧化酶活性進(jìn)行分析。過氧化氫酶作為魚類抗氧化酶系統(tǒng)的一種關(guān)鍵酶類，在氧化應(yīng)激時(shí)通過清除過氧化氫對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在亞硝態(tài)氮脅迫下，過氧化氫酶活性在亞硝態(tài)氮各質(zhì)量濃度組均呈先升后降的趨勢(shì)，該結(jié)果與在日本蟳(Charybdisjaponica)和羅氏沼蝦(Macrbrachiumrosenbergii)中的觀察結(jié)果一致[30-31]。這可能是因?yàn)閬喯鯌B(tài)氮短期脅迫會(huì)上調(diào)過氧化氫酶的表達(dá)量；但隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體產(chǎn)生的過量活性氧對(duì)脂類和蛋白造成氧化損傷，從而導(dǎo)致過氧化氫酶活性下降[31-33]。此外，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度對(duì)過氧化氫酶活性影響不顯著，這說明過氧化氫酶活性對(duì)亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度變化不敏感。

3.3 亞硝態(tài)氮對(duì)堿性磷酸酶活性的影響

Xu等[34]研究了日本沼蝦(M.nipponense)在急性和慢性亞硝態(tài)氮脅迫下的轉(zhuǎn)錄組變化，發(fā)現(xiàn)亞硝態(tài)氮對(duì)免疫相關(guān)的信號(hào)通路有不同程度的激活作用。堿性磷酸酶作為一類最重要的溶酶體酶，在免疫防御和細(xì)胞內(nèi)氧氣運(yùn)輸方面均起著關(guān)鍵作用[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，在亞硝態(tài)氮脅迫下，各質(zhì)量濃度組堿性磷酸酶活性均呈先降后升再下降的趨勢(shì)，該結(jié)果與日本沼蝦的研究報(bào)道一致[36]。這可能因?yàn)閴A性磷酸酶活性對(duì)亞硝態(tài)氮刺激反應(yīng)比較敏感，短時(shí)間內(nèi)(24 h)機(jī)體免疫能力受到抑制；但隨著機(jī)體免疫信號(hào)通路的打開，產(chǎn)生生理性代償作用，酶活性在48 h出現(xiàn)短暫恢復(fù)；此后隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)，機(jī)體受到損傷、免疫代謝平衡被打破，導(dǎo)致酶活性再次出現(xiàn)下降[37-39]。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，亞硝態(tài)氮對(duì)中華鳑鲏的急性毒性較強(qiáng)，因此在養(yǎng)殖過程中必須嚴(yán)格加以控制；亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度和暴露時(shí)間對(duì)堿性磷酸酶活性均有極顯著的影響，所以在套養(yǎng)模式中還可以考慮利用中華鳑鲏對(duì)環(huán)境中的亞硝態(tài)氮敏感性進(jìn)行早期預(yù)警。