色素添加對咖啡金黃水母體色影響的初步研究

楊翠華，王文章，陳華增，齊繼光

(青島海洋科技館，山東 青島 266003 )

咖啡金黃水母(Chrysaoramelanaster)又稱咖啡海刺水母，屬刺胞動物門、缽水母綱、旗口水母目、游水母科、金黃水母屬。主要生活在日本的白令海，在我國未見報道。雖然該水母中膠層薄，食用價值低，但其外形優(yōu)美，游姿優(yōu)雅，具極高的觀賞性，近年來許多水族館對其進(jìn)行人工飼養(yǎng)、繁殖和展示[1-2]。

根據(jù)筆者多年飼養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，目前在高密度人工養(yǎng)殖條件下，多種水母出現(xiàn)了身體褪色和狀態(tài)下降等問題，嚴(yán)重降低了觀賞價值，增加了繁育成本。楊翠華等[3]認(rèn)為，巴布亞硝水母(Mastigiaspapua)的外觀顏色是體內(nèi)膠藍(lán)蛋白、蟲黃藻(Zooxanthella)和環(huán)境光線之間相互作用的結(jié)果。在人工養(yǎng)殖條件下，這種平衡會被破壞，導(dǎo)致水母顏色發(fā)生改變。因此，目前迫切需要對水母的著色與變色機(jī)理進(jìn)行探討，找到養(yǎng)殖條件下水母變色的原因，并加以解決，從而使養(yǎng)殖品種體色更接近天然品種，提高觀賞價值。

魚類的體色主要是由一類稱之為類胡蘿卜素的色素決定，黑色素、嘌呤和虹彩細(xì)胞等也參與體色形成，同時體色也與魚的生理狀態(tài)和環(huán)境因素等有關(guān)[4-5]。但是，水母的體色細(xì)胞及相關(guān)的顯色機(jī)理研究尚未見報道。筆者參照魚體色的相關(guān)資料，結(jié)合多年的水母飼養(yǎng)經(jīng)驗和咖啡金黃水母自身的特點，開展本次研究，觀察色素添加劑對水母體色的影響，并探討體內(nèi)酪氨酸酶活力、總類胡蘿卜素含量等指標(biāo)與外觀體色的相關(guān)程度，以期解決人工飼養(yǎng)水母色澤變暗的問題，對水母增色機(jī)理得出初步結(jié)論，得到觀賞性強(qiáng)的水母個體，為探究水母色素細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

試驗用咖啡金黃水母為青島海洋科技館繁育60 d的水母成體。水母飼養(yǎng)在0.6 m3水體的循環(huán)缸內(nèi)，試驗用水經(jīng)過黑暗沉淀、砂濾、臭氧、活性炭預(yù)處理，水溫18～20 ℃，鹽度32～33，pH 7.5～8.2，每周測定1次水質(zhì)，保證NO2-≤0.01 mL/L，NH4+≤0.1 mL/L，每日于10:00、14:00投喂，基礎(chǔ)餌料為鹵蟲(Artemia)無節(jié)幼體、水母顆粒餌料和海月水母(Aureliaaurita)汁體積1∶1∶1的混合物。

1.1.2 試驗試劑及其使用方法

1.1.2.1 人工食用色素

胭脂紅、檸檬黃、亮藍(lán)和果綠4種色素由廣東省東莞市御豪食品有限公司(生產(chǎn)許可證編號: QS441901040493)生產(chǎn)。用飼喂吸管將人工食用色素滴在水母口腕部，2 mL/只。

1.1.2.2 水溶性熒光色素

人工水溶性熒光色素?zé)晒饧t、熒光黃、熒光藍(lán)、熒光綠由南京聚恩科技有限公司生產(chǎn)。試驗時，用注射器將4種色素分別注入水母胃囊，2 mL/只。

1.1.2.3 蝦青素

美國CareNet公司生產(chǎn)的美國時刻原裝進(jìn)口天然蝦青素(雨生紅球藻中提取)，即3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素。試驗時，6 mg蝦青素粉末與20 g基礎(chǔ)餌料混勻，含量為300 mg/kg，用吸管投喂在水母的口腕部。

1.1.2.4 FeSO4

攀枝花市韋東工貿(mào)有限公司生產(chǎn)的分析純級FeSO4·7H2O。19.86 mg FeSO4·7H2O與20 g基礎(chǔ)餌料混勻，F(xiàn)e2+含量為200 mg/kg，用吸管投喂在水母的口腕部。

1.1.2.5 海蜇

每次稱取90 g青島海洋科技館繁殖飼養(yǎng)的90日齡海蜇(Rhopilemaesculentum)(圖1)，切成2～3 cm3碎塊，均勻放在水母口腕部，自主采食。

圖1 人工飼養(yǎng)90 d的海蜇

1.2 試驗方法

隨機(jī)將360只60日齡的試驗水母分為對照組、食用色素組(4種色素)、水溶性熒光色素組(4種色素)、蝦青素組、FeSO4組和海蜇組，觀察不同處理后的水母外觀體色、酪氨酸酶活力和總類胡蘿卜素含量的變化。水溶性熒光色素組僅在試驗第1 d注射1次熒光色素，正常飼喂基礎(chǔ)餌料1個月，其余處理組日投喂2次，連續(xù)1個月。

1.3 試驗指標(biāo)測定方法

1.3.1 酪氨酸酶活力

取水母傘部或者口腕部3 g，加入1 mL pH 6.0的PBS緩沖液，冰凍勻漿，勻漿液在冰凍離心機(jī)上8000 r/min離心5 min，取上清液作為粗酶液(總?cè)芤捍笥? mL)。

取1 mg/mL L-酪氨酸0.5 mL，加入28 ℃預(yù)熱的2 mL酪氨酸酶粗酶液，總反應(yīng)體積為2.5 mL，混合后立即室溫下于UV5100紫外分光光度計490 nm處測定吸光度(OD0)，10 min后再測吸光度值(OD10)。按下式計算酶活力值：

ΔOD490=OD10-OD0

式中，V為樣品體積，t為時間。

1.3.2 總類胡蘿卜素含量的測定

準(zhǔn)確稱取3 g鮮樣品于25 mL棕色容量瓶中。加入7.5 mL浸提液(無水乙醇∶丙酮=5∶5)，蓋上塞子并旋轉(zhuǎn)振搖1 min。用移液管加入1 mL 40%KOH甲醇—水溶液(稱取200 g KOH溶解于50 mL水，用甲醇定容至500 mL)于容量瓶中，旋轉(zhuǎn)振搖1 min，將容量瓶于55.5 ℃水浴上加熱20 min，在容量瓶頸接上空氣冷凝裝置以防止溶劑損失。冷卻樣品，于暗處放置1 h。加入7.5 mL正己烷，旋轉(zhuǎn)振搖1 min，以10%硫酸鈉溶液定容，猛烈振搖1 min。于暗處靜置1 h后，將上層液放入1 cm比色皿中，以正己烷、丙酮混合液為空白對照(加蓋防止丙酮揮發(fā))，在UV5100紫外分光光度計下300～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，找出最大吸收峰所處的波長，在該波長下測定各組提取液的吸光值。測定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度類胡蘿卜素，獲得本試驗的摩爾消光系數(shù)。

總類胡蘿卜素含量/mg·kg-1=(A×K×V)/(E×G)

式中，A為吸光度，K為稀釋倍數(shù)，V為提取液體積，E為摩爾消光系數(shù)，G為樣品質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，計算測定指標(biāo)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗。使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 水母體色變化

水母口腕部接觸人工食用色素后，在3～10 min色素到達(dá)胃囊腔，并沿輻管快速擴(kuò)散。果綠色、胭脂紅色和檸檬黃色染色水母體色晶瑩透亮，亮藍(lán)色顏色略暗，但是4種色素均大大提升水母的觀賞性(圖2)。15～20 min后，水母通過傘部的輻管和觸手將色素開始排入水中，排出色素的過程持續(xù)2～3 h?？谕蟛恐饕俏丈兀瑐悴枯椆苤荒芘懦錾?，僅有很少色素通過口腕部和觸手排出。色素的吸收和排出時間與色素種類無關(guān)，僅與接觸色素的部位相關(guān)。3 h后，每組水母均恢復(fù)原來的體色，4種色素間無差異，水母狀態(tài)未發(fā)現(xiàn)改變。30 d后水母全部存活，體色和狀態(tài)與未飼喂色素的水母(對照組)(圖2a)無明顯差異。

圖2 飼喂人工食用色素后咖啡金黃水母體色變化a.繁育60 d未飼喂色素的水母，b.飼喂果綠色素的水母，c.飼喂亮藍(lán)色素的水母，d.飼喂胭脂紅色素的水母，e.飼喂檸檬黃色素的水母.

水母口腕部接觸水溶性熒光色素后，不能將色素吸收到胃囊腔，但可以用2 mL注射器通過水母十字型口將熒光色素直接注入。熒光色素注入胃囊腔后，積聚在一起，10 h后才能通過水循環(huán)擴(kuò)散到全身。注入熒光色素第1 d的效果見圖3。熒光染料對水母染色效果明顯，在第10 d時仍能很好地保持色素顏色，并且不影響流水母采食和存活，其狀態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯改變。至第15 d，水母體色逐漸變淺，但仍能觀察到熒光色素的顏色，并且未對水母狀態(tài)產(chǎn)生影響(圖4)。30 d試驗結(jié)束時，水母體仍能觀察到少許顏色，水母體態(tài)和大小與對照組無明顯差異。

圖3 飼喂水溶性熒光色素第1 d咖啡金黃水母體色變化a.熒光綠，b.熒光藍(lán)，c.熒光紅，d.熒光黃.

圖4 飼喂水溶性熒光色素第15 d咖啡金黃水母體色變化a.熒光綠，b.熒光藍(lán)，c.熒光紅，d.熒光黃.

咖啡金黃水母添加天然蝦青素、FeSO4和含有色素的海蜇30 d后，海蜇組的水母(圖5)比對照組顏色要深，而蝦青素組(圖6)、FeSO4組(圖7)的水母與對照組差異不明顯。結(jié)果表明，人工添加色素能獲得顏色各異的水母，水溶性熒光色素能長期保存在動物體內(nèi)，可以作為染色色素，長期飼喂海蜇能夠維持自然狀態(tài)的體色，而添加蝦青素和FeSO4不能改善人工繁育水母的體色。

圖5 飼喂海蜇30 d的水母

圖6 添加蝦青素30 d的水母

圖7 添加FeSO430 d的水母

2.2 各處理組水母體內(nèi)酪氨酸酶活力和總胡蘿卜素含量

試驗結(jié)果顯示，各組水母酪氨酸酶活力均較低，最高為海蜇組的0.133 U/mL(表1)，可能與咖啡金黃水母色素僅分布于外傘表面、色素含量較少有關(guān)。食用色素組和熒光色素組水母雖然體色鮮亮，但是因為色素并未在表皮和中膠層形成色素沉淀，因此本結(jié)果中兩項指標(biāo)均與對照組差異不顯著(P>0.05)。添加蝦青素未顯著改變水母的體色，在本試驗中，蝦青素組酪氨酸酶活力最低，僅為0.109 U/mL。各組內(nèi)個體間酪氨酸酶活力差異較大，F(xiàn)eSO4組和海蜇組的標(biāo)準(zhǔn)偏差大于測量平均值，并且6個樣本出現(xiàn)負(fù)值。各組間差異不顯著(P>0.05)。

經(jīng)過分光光度計波長掃描，咖啡金黃水母中總胡蘿卜素在450 nm處吸光值最高。本方法中，海蜇組總胡蘿卜素含量最高，為251.01 mg/kg，與對照組差異顯著(P<0.05)。食用色素組總胡蘿卜素含量最低，酪氨酸酶活力僅高于蝦青素組，但與對照組差異均不顯著(P>0.05)。熒光色素組、蝦青素組、FeSO4組和對照組差異均不顯著(P>0.05)。

表1 4組水母酪氨酸酶活力和總胡蘿卜素含量

3 討 論

3.1 人工食用色素對水母體色的影響

本試驗中所用的4種色素均為人工合成的化學(xué)色素。胭脂紅、檸檬黃為偶氮類水溶性色素，亮藍(lán)是非偶氮色素，而果綠是檸檬黃和亮藍(lán)的混合物。胭脂紅給予大鼠口服時，大部分3～6 h后在盲腸和肝臟內(nèi)被還原成1-氨基萘-4-磺酸和1-氨基-2-萘酚-6,8-二磺酸(NA)，被吸收的色素經(jīng)膽道排泄[6]。兔經(jīng)口攝入檸檬黃，48 h后分析尿液，得到原形色素(1%)、對氨基苯磺酸(74%)和對乙酞氨基苯磺酸(22%)，而對氨基苯磺酸正是合成檸檬黃的原料[7]。這表明胭脂紅和檸檬黃在大鼠及兔體內(nèi)均很快被分解排出，難以在體內(nèi)積累。由于亮藍(lán)色素易揮發(fā)并且穩(wěn)定性差，在自然光照條件下，極易被氧化分解，很難被機(jī)體消化吸收[8]。將該4種食用色素以2‰的比例加入基礎(chǔ)飼料中投喂金魚110 d，對體色無顯著影響[9]。

本試驗表明，4種人工食用色素可在短期內(nèi)明顯改變試驗水母體色，但會隨水循環(huán)快速代謝到外界，長期投喂也不能被水母吸收或吸收量甚微。正如色澤鮮艷的魚飼料僅能短期增加魚的觀賞性一樣[9]，雖然市面上有各種顏色的水母餌料，但本試驗證明，通過添加人工食用色素改變水母體色的方法是難以達(dá)到持續(xù)維持的?？Х冉瘘S水母分為傘部和口腕部，本試驗色素的流動證明，口腕部和傘部的觸手不僅是采食器官，同時也具有排泄功能，消化后的食物轉(zhuǎn)化為液體或者細(xì)小顆粒，除主要通過傘部的輻管排出體外，少部分也能通過口腕部和傘部的觸手排泄。

3.2 水溶性熒光色素對水母體色的影響

熒光色素可分為堿性、酸性和中性熒光色素。本試驗用到的為中性的人工合成熒光色素，主要用于彩繪涂鴉、手工創(chuàng)意禮品、夜間警示、印染等領(lǐng)域，為生物不可分解物質(zhì)。本試驗中熒光色素可以長期保存在水母胃囊內(nèi)，對水母體的染色時間較長。注射后，熒光色素中水溶性部分?jǐn)y帶部分小分子色素快速擴(kuò)散，油溶性部分逐漸形成大顆粒，1 d后隨食物擴(kuò)散到整個胃囊腔、輻管、觸手和口腕部，染色效果明顯，可保持30 d以上。并且因為色素在水母體內(nèi)以大顆粒狀態(tài)存在，因此對水母采食、游動等無影響。本方法簡單易操作，在實踐中可提高水母的觀賞性，可用于水母染色。

3.3 蝦青素對水母體色的影響

蝦青素進(jìn)入動物體后，可以不經(jīng)修飾或生物轉(zhuǎn)化而直接貯存、沉淀在組織中，并可與肌動蛋白非特異性結(jié)合。汪洪濤等[10]認(rèn)為，蝦青素在金魚體內(nèi)以酯化形式沉淀，不同添加量和飼養(yǎng)時間對金魚的色素沉積有著極為顯著的影響。Booth等[11]研究表明，在澳大利亞金赤鯛(Pagrusauratus)餌料中添加蝦青素，72 mg/kg蝦青素組較36 mg/kg蝦青素組更易增加體色，但是兩者在飼喂6周和9周后皮膚顏色達(dá)到一致。本試驗中，添加蝦青素組水母狀態(tài)、游動能力和生長速度較其他組強(qiáng)，與野生水母接近，說明蝦青素能促進(jìn)水母的生長，增強(qiáng)水母的體質(zhì)。但蝦青素組的酪氨酸酶活力和總胡蘿卜素含量均較低，說明與其他水產(chǎn)動物和家禽類不同[12]，水母體內(nèi)不含有肌動蛋白，因此短期添加蝦青素并不能改善水母體色。

3.4 FeSO4和海蜇對水母體色的影響

鐵是動物機(jī)體最必需的微量元素之一，它的主要功能是構(gòu)成血紅蛋白，參與氧氣的運輸，是肌紅蛋白及細(xì)胞色素酶、過氧化物酶等的必需組成成分。影響日糧中鐵吸收的主要因素是有機(jī)和無機(jī)鐵的比例。動物源性飼料，如魚粉和肉粉中鐵的含量比較高，約為400～800 mg/kg，油類作物中含鐵100～200 mg/kg，谷物中含鐵30～60 mg/kg[13]。劉希光等[14]測定了新鮮海蜇皮、海蜇頭、生殖腺的含水量分別為95.89%、96.39%和96.09%，并利用JY38S型順序掃描電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定了上述部位新鮮海蜇樣品中鐵的含量分別為0.06、0.07、0.83 μg/L。

養(yǎng)殖條件下，許多水產(chǎn)動物體色會發(fā)生變化，如黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[15]、胡子鲇(Clariasfuscus)[16]等。本試驗在不添加外源色素的條件下，通過添加FeSO4，觀察微量元素鐵的補充對水母體表色素的影響。結(jié)果表明，添加外源性鐵對水母體色影響較小。飼喂海蜇能使水母體色加深，可能與海蜇含有色素有關(guān)，也可能是由于海蜇通過影響水母酶代謝等途徑促進(jìn)了水母鐵的吸收和色素的沉積。

3.5 酪氨酸酶活力對水母體色的影響

動物體色與黑色素沉淀密切相關(guān)，酪氨酸酶在黑色素生成過程中起關(guān)鍵作用。在魚體內(nèi)，酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴，再經(jīng)過一系列的生化反應(yīng)，最終生成黑色素。目前研究表明，黑色素不能正常形成主要有以下幾種原因[13]：

一是黑素細(xì)胞形態(tài)正常，但細(xì)胞中黑色素體的分布發(fā)生變化，這是動物短時間處于淺色背景、或光線較強(qiáng)等條件下發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)這些條件解除后，動物體色也恢復(fù)正常。在多年飼養(yǎng)過程中，筆者發(fā)現(xiàn)，水母體色與溫度、光照、背景等外部環(huán)境相關(guān)[3]，但這是一個長期過程，水母很少出現(xiàn)體色的驟然變化。

二是黑素細(xì)胞的生長狀態(tài)發(fā)生劇烈變化，細(xì)胞出現(xiàn)衰老、死亡，表現(xiàn)在黑素細(xì)胞樹突狀分支逐漸消失或減少、細(xì)胞萎縮，逐漸凋亡，這種變化通常使動物體色發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化?？Х冉瘘S水母在不同生長階段顏色表現(xiàn)不同，剛剛分裂的碟狀體呈紅色，水母幼體為無色透明狀，而水母成體外傘具18～24條咖啡色條紋，同時觸手和口腕部呈咖啡色[1]，日齡越大，水母顏色越深，說明生長過程中有黑色素生成和積累。

三是黑素細(xì)胞的分化、增殖受到影響，生物合成發(fā)生障礙，使成熟的黑素細(xì)胞數(shù)量顯著減少。本試驗中，添加海蜇組水母體色眼觀有明顯加深，而蝦青素雖然能增強(qiáng)水母的狀態(tài)，使水母生長速度加快，但是外觀顏色未發(fā)生改變。FeSO4組各項指標(biāo)均較對照組無顯著差異。各組水母酪氨酸酶活力較低且差異不顯著，對照組僅為(0.126±0.093) U/mL，而黃顙魚血清中酪氨酸酶活力為(2.16±0.528) U/mL[15]，可能與水母色素僅僅分布于外傘表面，并且合成數(shù)量較少有關(guān)。

3.6 類胡蘿卜素對水母體色的影響

機(jī)體顏色濃淡的變化，是由于細(xì)胞內(nèi)色素的集中、分散以及色素細(xì)胞數(shù)量的多少決定的。觀賞魚的豐富色彩可以通過含類胡蘿卜素的食物鏈而獲得。向梟等[17]報道，在紅劍尾魚(Xiphophorushelleri)和花瑪麗魚(Molliensiavelifera)養(yǎng)殖中添加50 mg/kg的類胡蘿卜素能有效地改善魚的體色，提高其觀賞價值。用添加100 mg/kg蝦青素的餌料投喂虹鱒(Oncorhynchusmykiss)4周，血清總類胡蘿卜素含量(1.83 μg/mL)極顯著高于對照組(0.25 μg/mL)[18]。

本試驗咖啡金黃水母中的類胡蘿卜素在450 nm處有最大吸收值，與向梟等[17]測定的魚類類胡蘿卜素在450 nm處有最大吸收值相同，說明兩者含有的類胡蘿卜素種類類似。本試驗中，海蜇組咖啡金黃水母體色最深，測定的酪氨酸酶活力和類胡蘿卜素含量也最高，說明水母的色素合成、沉淀可能與這兩項指標(biāo)有關(guān)。

在日常飼養(yǎng)過程中，決定水母質(zhì)量和狀態(tài)的不僅僅是體色，實踐證明，微量元素的合理補充對高質(zhì)量的飼養(yǎng)仍是必須的，對水母體內(nèi)類胡蘿卜素的積累也是有利的。