光徑及氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻生長(zhǎng)、油脂和花生四烯酸積累的影響

印尤強(qiáng) 黃羅冬 胡 強(qiáng) 張成武

(1. 暨南大學(xué)生物工程學(xué)系, 廣州 510632; 2. 暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系, 水生生物研究中心, 廣州 510632; 3. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 4. 中國(guó)電子工程設(shè)計(jì)院, 國(guó)投微藻生物科技中心, 北京 100142)

缺刻緣綠藻(Parietochloris incisa)是一種單細(xì)胞綠藻, 它隸屬于綠藻門(Chlorophyta), 共球藻綱(Trebouxiophyceae), 自1996年在日本富山縣被首次分離發(fā)現(xiàn)[1]。前人研究表明, 缺刻緣綠藻的細(xì)胞內(nèi)含有豐富的花生四烯酸(Arachidonic acid, AA), 在氮饑餓條件下, 可以達(dá)到細(xì)胞脂肪酸含量(TFA)的60%, 占干重(DW)的21%[2]。

AA屬于人體必需脂肪酸, 是前列腺素、血栓烷素等的前體[3,4], 對(duì)人體發(fā)育具有十分重要的功能, 已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注。而傳統(tǒng)生產(chǎn)AA的方式, 主要是從動(dòng)物組織中提取, 如豬腎上腺、魚(yú)油和蛋黃等, 但此法生產(chǎn)不僅來(lái)源受限并且產(chǎn)量很低, 遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求[5,6]。但是缺刻緣綠藻則具有生長(zhǎng)速度快, 體積小等幾乎微藻的所有特性,并且90%以上的AA也都儲(chǔ)存在三酰基甘油(TAG)中[2,7,8], 這無(wú)不提示我們對(duì)利用缺刻緣綠藻工業(yè)化生產(chǎn)AA, 具有巨大的應(yīng)用潛力與前景。

研究表明, 微藻的生長(zhǎng)以及色素和多不飽和脂肪酸的積累等, 不僅直接與光照[9,10]、溫度[11]、pH[12]和CO2濃度[13]等因子相關(guān), 也與培養(yǎng)的光生物反應(yīng)器的光徑(LP)有關(guān)[14,15]。Richmond等[16]研究了5種不同光徑條件下培養(yǎng)微擬球藻(Nannochloropsissp.), 其結(jié)果表明在1.3 cm最短光徑時(shí), 細(xì)胞達(dá)到最大體積產(chǎn)率[0.846 g/(L·d)], 而在10.0 cm光徑條件下達(dá)到最大面積產(chǎn)率[12.10 g/(m2·d)]。同樣, 趙萍等[17]研究了5.0、10.0、15.0和20.0 cm四種光徑對(duì)三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)生長(zhǎng)及有機(jī)物質(zhì)積累的影響, 發(fā)現(xiàn)在5.0 cm光徑下有最大的藻細(xì)胞生物量和單位體積的總脂產(chǎn)量。Zhang等[18]用2種光徑(1.0和3.0 cm)培養(yǎng)缺刻緣綠藻的研究表明, 其在1.0 cm較短光徑處生物量達(dá)到最大, 為8.8 g/L, 但AA含量及平均面積產(chǎn)量在3.0 cm處更高, 為90 mg/g和478 mg/(m2·d)。

此外, 氮元素是微藻生長(zhǎng)所必須的重要營(yíng)養(yǎng)元素[19]。通常說(shuō)來(lái), 在氮饑餓條件下, 微藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)的含量會(huì)降低, 而碳水化合物或油脂含量卻明顯升高[20,21]。很多研究也已經(jīng)表明: 充足的氮是保證缺刻緣綠藻生長(zhǎng)的必要條件, 而氮匱乏卻能顯著促進(jìn)其油脂和AA的積累[10,22]。因此, 氮濃度也是影響缺刻緣綠藻生長(zhǎng)及生化組成的重要因素。

本文利用了2種不同光徑的光生物反應(yīng)器, 并設(shè)定高低氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻進(jìn)行培養(yǎng), 以期在較為全面地了解光徑對(duì)缺刻緣綠藻細(xì)胞內(nèi)AA積累規(guī)律的基礎(chǔ)上, 為實(shí)際的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

缺刻緣綠藻(Parietochloris incisa)H4301來(lái)源于暨南大學(xué)水生生物研究中心微藻生物技術(shù)與生物能源實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與培養(yǎng)條件

在單側(cè)300 μmol/(m2·s)光強(qiáng)下, 實(shí)驗(yàn)選用BG-11培養(yǎng)基, 設(shè)定17.6和1.0 mmol/L兩種氮濃度, 分別在不同光徑的柱狀光生物反應(yīng)器(LP=6.0、4.5和2.5 cm)和平板光生物反應(yīng)器(LP=5.0、3.0和1.5 cm;亞克力材質(zhì), 其厚度為1.0 cm)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中,柱狀光生物反應(yīng)器中通入富含1% CO2空氣壓縮氣,而平板光生物反應(yīng)器中通入富含2% CO2空氣壓縮氣; 熒光燈管24h持續(xù)光照, 培養(yǎng)溫度均為(25±1)℃。實(shí)驗(yàn)初始接種細(xì)胞藻液密度OD750為0.60±0.02, 培養(yǎng)周期均為14d。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

生物量測(cè)定將Whatman GF/C濾膜編號(hào),放置于105℃烘箱中過(guò)夜烘干至恒重, 于干燥器中冷卻至常溫后稱量(M1)。隔24h收取藻液樣10 mL,用恒重后的Whatman GF/C濾膜進(jìn)行真空抽濾, 隨后, 將帶有藻細(xì)胞的濾膜同樣過(guò)夜烘干至恒重, 于干燥器中冷卻至常溫后稱量(M2)。通過(guò)重量差法計(jì)算得到單位體積藻液干重(DW, g/L), 即生物量(Biomass, g/L)=(M2-M1)×1000/10 mL。

藻粉制備定時(shí)收取一定體積的藻液, 然后用冷凍離心機(jī)設(shè)定轉(zhuǎn)速為3500 r/min, 將其離心5min;棄去上清, 放置于-40℃冰箱中凍結(jié), 然后用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥。凍干后的藻粉置于4℃冷藏待用。

總脂含量測(cè)定總脂含量的測(cè)定采用重量法[23]并進(jìn)行稍加改進(jìn)[24]。稱取凍干藻粉80 mg, 加入帶有磁性轉(zhuǎn)子的玻璃離心管, 然后加入2 mL 10%二甲亞砜-甲醇溶液(1∶9,v∶v), 振蕩搖勻后置于50℃水浴中磁力攪拌約2h, 然后再冰浴磁力攪拌1.5h, 完成后將各管取出3000 r/min離心5min, 用滴管吸取上清置于潔凈干燥的小玻璃瓶中。然后加入4 mL乙醚-正己烷溶液(1∶1,v∶v)于剩余藻渣中,振蕩搖勻后置于冰浴中磁力攪拌1h, 同樣, 離心(3000 r/min, 5min)取上清加入對(duì)應(yīng)的小玻璃瓶中。將上述操作重復(fù)進(jìn)行一次, 保證最后的藻渣為灰白色。向收集上清的小玻璃瓶加入4 mL蒸餾水, 靜置分層過(guò)夜。用滴管小心吸取小玻璃瓶中分層后的上清于潔凈玻璃離心管中, 離心(3000 r/min, 5min),將上清轉(zhuǎn)移至潔凈干燥的小玻璃瓶。氮吹儀吹干濃縮后, 再分別用乙醚洗滌裝移至預(yù)先稱重的2 mL塑料離心管, 然后氮吹至恒重。利用差量法計(jì)算出藻粉中總脂含量(ωTL), 即ωTL(% DW)=(m2-m1)/m×100%。式中:m2為塑料離心管和總油脂質(zhì)量(g);m1為塑料離心管質(zhì)量(g);m為稱取的藻粉質(zhì)量(g)。

脂肪酸分析參照Laurens等[25]和Christie等[26]的方法進(jìn)行, 具體見(jiàn)[24]中的脂肪酸分析。

1.4 產(chǎn)率計(jì)算公式

(1)總脂單位體積產(chǎn)率[Total lipids volumetric productivity, mg/(L·d)]=ωTL×DW×1000/t; (2)總脂單位面積產(chǎn)率[Total lipids areal productivity, mg/(m2·d)]=(ωTL×DW×1000/t)×V×1000/1 m2; (3) AA單位體積產(chǎn)率[AA volumetric productivity, (mg/(L·d)]=ωAA×DW×1000/t; (4) AA單位面積產(chǎn)率 [AA areal productivity, (mg/(m2·d)]=(ωAA×DW×1000/t)×V×1000/1 m2

式中: DW代表藻體干重(g/L);ωTL代表總脂含量(% DW);t代表培養(yǎng)時(shí)間(d);V代表1 m2光照面積所對(duì)應(yīng)的藻液培養(yǎng)體積(m3);ωAA代表AA的絕對(duì)含量(% DW)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0中單因素方差(ANOVA)分析及多重比較(LSD), 并用Excel 2010和Origin 8.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理和作圖,P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 光徑及氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻生長(zhǎng)的影響

研究結(jié)果顯示, 光徑的大小對(duì)缺刻緣綠藻的生物量有顯著影響(圖1)。在柱狀光生物反應(yīng)器中(圖1A、1B), 當(dāng)光徑為6.0 cm時(shí), 缺刻緣綠藻的最大生物量為3.79 g/L, 而當(dāng)光徑變?yōu)?.5和2.5 cm時(shí), 缺刻緣綠藻的最大生物量有了顯著提高分別可以達(dá)到4.61和5.09 g/L (P＜0.05)。由此說(shuō)明, 降低光徑可以進(jìn)一步促進(jìn)缺刻緣綠藻的生長(zhǎng)。而在1.0 mmol/L NaNO3條件下, 缺刻緣綠藻在三種光徑下的最大生物量均顯著降低, 最高生物量在6.0 cm光徑下獲得,為2.31 g/L。

同樣, 平板光生物反應(yīng)器的光徑也影響缺刻緣綠藻的生長(zhǎng)速率(圖1C、1D), 1.5 cm光徑的平板光生物反應(yīng)器中, 缺刻緣綠藻的生長(zhǎng)速率最快, 在第11天達(dá)到最大, 為2.93 g/L; 而在5.0 cm平板中的最大生物量, 僅為2.48 g/L。當(dāng)NaNO3氮濃度降低為1.0 mmol/L時(shí), 缺刻緣綠藻的生物量也均有一定程度的降低; 但此時(shí)的最大生物量也是在較大光徑(5.0和3.0 cm)處獲得, 而在1.5 cm光徑處的最大生物量?jī)H為2.17 g/L。

2.2 光徑及氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻油脂積累的影響

研究顯示, 光徑及氮濃度也顯著影響缺刻緣綠藻細(xì)胞內(nèi)的油脂積累(圖2)。在柱狀光生物反應(yīng)器中(圖2A、2B), 當(dāng)光徑為6.0 cm時(shí), 在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)缺刻緣綠藻的油脂無(wú)明顯積累, 最終油脂含量?jī)H為23.23%。當(dāng)光徑減小到4.5 cm時(shí), 油脂含量為28.97%, 繼續(xù)降低光徑為2.5 cm時(shí), 缺刻緣綠藻的油脂含量可以達(dá)到34.98%(12d)。而隨著NaNO3氮濃度降低為在1.0 mmol/L, 在6.0和4.5 cm光徑下的最大油脂含量顯著升高, 分別可以達(dá)到39.23%和38.18%, 但與2.5 cm光徑下的油脂含量(35.88%)相比, 三者無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

而在平板光生物反應(yīng)器中(圖2C、2D), 當(dāng)光徑從5.0 cm降低為3.0和1.5 cm時(shí), 這對(duì)缺刻緣綠藻油脂積累的促進(jìn)作用不顯著, 三者的最大油脂含量分別24.43%、26.39%和28.51% (P＞0.05)。同樣, 隨著氮濃度的顯著降低, 在5.0、3.0和1.5 cm三種不同光徑條件下培養(yǎng)的油脂含量均顯著增加, 分別可以達(dá)到40.74%、39.17%和37.23% (P＞0.05)。

圖1 光徑及氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effects of different light-path and nitrogen concentration on the growth of Parietochloris inicsa

2.3 光徑及氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻脂肪酸組分的影響

光徑及氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻主要脂肪酸組分及含量有顯著影響(表1和表2)。在柱狀光生物反應(yīng)器中(表1), 在全氮條件下培養(yǎng)的缺刻緣綠藻細(xì)胞內(nèi)C18∶1、C18∶3ω-6的相對(duì)含量(% TFA)隨著光徑的減小顯著升高, 而C16∶0、C16∶3、C18∶3ω-3、C20∶3、C20∶4 (AA)和C20∶5的相對(duì)含量則隨著光徑的減小而減小(P＜0.05)。因此, AA相對(duì)含量在6.0 cm光徑處達(dá)到最大(24.11%), 而最大總脂肪酸含量則在2.5 cm光徑處獲得(22.56%, % DW)。當(dāng)NaNO3氮濃度降為1.0 mmol/L時(shí), AA相對(duì)含量也在寬光徑處較高, 且同時(shí)最大總脂肪酸含量也在6.0 cm光徑處獲得, 為38.24% (% DW)。

在全氮條件下, 平板光生物反應(yīng)器中的總脂肪酸組分及變化規(guī)律(表2)與柱狀光生物反應(yīng)器中類似: C18∶1的相對(duì)含量也隨著光徑的減小顯著升高,而C16∶0、C18∶2、C18∶3ω-3、C20∶4和C20∶5的相對(duì)含量均隨著光徑的減小而減小(P＜0.05)。其中,AA相對(duì)含量也是在最大光徑的平板光生物反應(yīng)器(LP=5.0 cm)中達(dá)到最大, 為20.43%; 但在3種光徑培養(yǎng)下的總脂肪酸含量, 差異不大。而在1.0 mmol/L NaNO3時(shí), 部分脂肪酸組分呈現(xiàn)的規(guī)律則有所不同,但C18∶1的相對(duì)含量仍隨著光徑的減小而增大, 同時(shí)C18∶0、C16∶3和C20∶4的相對(duì)含量則顯著降低(P＜0.05)。其中, AA相對(duì)含量和總脂肪酸含量均在5.0 cm光徑的平板光生物反應(yīng)器中獲得最大, 分別為39.56%和28.64% (% DW)。

圖2 光徑及氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻油脂積累的影響Fig. 2 Total lipid content in Parietochloris inicsa cultured under different light-path and nitrogen concentrations

表1 在不同光徑的柱狀光生物反應(yīng)器中, 不同氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻第14 天主要脂肪酸含量和總脂肪酸絕對(duì)含量的影響Tab. 1 The main fatty acids compositions and total fatty acid contents (TFA, % DW) of Parietochloris incisa in the different light-path of column photobioreacors under two kinds of nitrogen concentrations

2.4 光徑及氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻花生四烯酸(AA)積累的影響

由圖3A可以看出, 6.0、4.5和2.5 cm三種光徑的柱狀光生物反應(yīng)器中, 其AA絕對(duì)含量(% DW)差別不大, 其中在4.5 cm處的AA絕對(duì)含量較高, 為3.50%。當(dāng)?shù)獫舛冉档蜑?.0 mmol/L, 3種光徑下的AA絕對(duì)含量均顯著升高; 此時(shí), 當(dāng)光徑為6.0 cm時(shí),更有利于AA的積累, 其絕對(duì)含量可以達(dá)到13.21%。

平板光生物反應(yīng)器中AA的積累與柱狀光生物反應(yīng)器類似(圖3B), 在全氮條件下, 3種光徑培養(yǎng)缺刻緣綠藻第14天的AA含量均不高; 在最窄光徑(LP=1.5 cm)時(shí), AA絕對(duì)含量最低, 僅為1.49%。同樣, 在低氮濃度時(shí), 3種光徑條件下的AA絕對(duì)含量顯著升高; 其中, 也是在最大光徑(LP=5.0 cm)時(shí),AA絕對(duì)含量達(dá)到最大, 為11.33%。

2.5 光徑及氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻油脂和花生四烯酸(AA)產(chǎn)率的影響

由圖4A、4B可知, 在柱狀光生物反應(yīng)器中, 在2種氮濃度條件下的最大油脂單位體積產(chǎn)率均在2.5 cm光徑中獲得, 分別為216.39 mg/(L·d)(17.6 mmol/L)和152.79 mg/(L·d)(1.0 mmol/L)。最終油脂單位體積產(chǎn)率, 則由于氮濃度的不同而有所差異: 其中, 在全氮條件下, 在2.5 cm光徑中達(dá)到最大[121.93 mg/(L·d)]; 而在低氮條件下, 則在6.0 cm光徑時(shí)油脂單位體積產(chǎn)率更高[63.61 mg/(L·d)]。同樣, 在平板光生物反應(yīng)器中(圖4C、4D), 油脂單位體積產(chǎn)率也是在最窄光徑1.5 cm處達(dá)到最大, 分別為135.03 mg/(L·d)(17.6 mmol/L)和135.93 mg/(L·d)(1.0 mmol/L)。另外, 我們計(jì)算了平板光生物反應(yīng)器中的油脂單位面積產(chǎn)率發(fā)現(xiàn): 在兩種氮濃度條件下, 均在5.0 cm最大光徑時(shí), 有最大油脂單位面積產(chǎn)率, 分別為3758.96和4421.88 mg/(m2·d)(圖4E、4F)。

表2 在不同光徑的平板光生物反應(yīng)器中, 不同氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻第14天主要脂肪酸含量和總脂肪酸絕對(duì)含量的影響Tab. 2 The main fatty acids compositions and total fatty acid contents (TFA, % DW) of Parietochloris incisa in the different light-path of flat plate photobioreacors under two kinds of nitrogen concentrations

圖3 光徑及氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻第14天花生四烯酸(AA)積累的影響Fig. 3 Arachidonic acid (AA) contents in Parietochloris incisa after 14 days of cultivation under different light-path and nitrogen concentrations

缺刻緣綠藻第14天AA產(chǎn)率也受光徑及氮濃度的影響(圖5)。在柱狀光生物反應(yīng)器中(圖5A),17.6 mmol/L全氮條件下, 不同光徑條件下的最終AA單位體積產(chǎn)率差別不大; 而在1.0 mmol/L低氮條件下, 6.0 cm光徑下的AA單位體積產(chǎn)率最大, 為21.65 mg/(L·d), 顯著高于4.5 cm [9.27 mg/(L·d)]和2.5 cm光徑[5.93 mg/(L·d)]。對(duì)于平板光生物反應(yīng)器(圖5B、5C), 也是在5.0 cm最大光徑, 1.0 mmol/L NaNO3時(shí), 有最大AA單位體積和面積產(chǎn)率, 分別為19.42 mg/(L·d)和971.17 mg/(m2·d)。

3 討論

規(guī)?；a(chǎn)微藻的光生物反應(yīng)器主要分為開(kāi)放式和封閉式2種類型[27]。其中, 開(kāi)放式光生物反應(yīng)器, 如跑道池, 具有培養(yǎng)生物質(zhì)濃度低、易受外界環(huán)境影響、極易污染等缺陷, 因此, 目前只應(yīng)用了少數(shù)幾種微藻如鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)、螺旋藻(Spirulina)、小球藻(Chlorella)的培養(yǎng)[27,28]。而封閉式光生物反應(yīng)器則具有條件容易控制、生產(chǎn)周期長(zhǎng)以及環(huán)境衛(wèi)生良好等優(yōu)勢(shì)[29,30], 這也恰好與利用缺刻緣綠藻生產(chǎn)AA的要求不謀而合[31]。其中, 柱狀光生物反應(yīng)器和平板光生物反應(yīng)器, 則又是封閉式光生物反應(yīng)器的典型代表[30]。

利用封閉式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)微藻, 其中光徑則是一個(gè)非常重要的設(shè)計(jì)因素, 它直接影響藻細(xì)胞接觸光的幾率。一般說(shuō)來(lái), 光徑越小, 微藻吸收的光照越多, 因此生長(zhǎng)越快; 反之, 則不僅會(huì)造成光衰減嚴(yán)重, 而且微藻細(xì)胞之間的相互遮擋也更為嚴(yán)重,從而導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)緩慢, 同時(shí)也更容易受到污染或者滋生病蟲(chóng)害[32]。

圖4 光徑及氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻油脂單位體積和面積產(chǎn)率的影響Fig. 4 Total lipid volumetric and areal productivity in Parietochloris incisa under the different light-path and nitrogen concentrations

在本研究結(jié)果中, 在17.6 mmol/L NaNO3、窄光徑處, 缺刻緣綠藻有最大生物量(圖1A、1C)。這與展望等[33]研究2株土壤綠藻在不同光徑的柱狀光生物反應(yīng)器的結(jié)果一致: 窄光徑3.0 cm時(shí)培養(yǎng)的生物量顯著高于6.0 cm。同樣, 劉健國(guó)等[34]使用1.4和2.8 cm兩種光徑培養(yǎng)缺刻緣綠藻的結(jié)果也是1.4 cm光徑下的去灰分干重(AFDW, 16.5 g/L)顯著高于2.8 cm(9.8 g/L)。這很容易理解: 因?yàn)樵诘獫舛鹊葼I(yíng)養(yǎng)充足條件下, 細(xì)胞的生長(zhǎng)則主要受到光照的限制, 而光徑越大則影響了藻細(xì)胞受光, 因此較大光徑處的生物量則受到一定程度的限制。在低氮條件下, 同樣窄光徑中藻細(xì)胞前期的生長(zhǎng)速率明顯更快, 但在后期生長(zhǎng)速率明顯變緩, 導(dǎo)致最終生物量甚至更低(圖1B、1D)。我們推測(cè)這與藻細(xì)胞在低氮濃度時(shí), 更容易發(fā)生光抑制, 甚至光合器官的氧化損傷有關(guān)[35, 36]。

光徑的大小不僅直接影響微藻的生長(zhǎng), 對(duì)細(xì)胞的油脂含量也有顯著影響(圖2)。當(dāng)光徑變小, 最直接就是使得細(xì)胞隨機(jī)接受的光強(qiáng)增大, 使得細(xì)胞油脂含量升高[32]。本研究證明了這一點(diǎn): 在全氮條件下, 光徑變小顯著促進(jìn)細(xì)胞的油脂積累(圖2A)。另外, 光徑變小時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度會(huì)加快, 也會(huì)有可能造成氮、磷元素的營(yíng)養(yǎng)限制或者匱乏的原因,從而促進(jìn)細(xì)胞油脂積累[33,20]。但我們認(rèn)為這種情況發(fā)生的幾率較小, 通常需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間; 若能在培養(yǎng)過(guò)程中延長(zhǎng)培養(yǎng)周期或者增加氮濃度梯度, 這對(duì)于把握光徑和氮濃度之間的規(guī)律將更加明了。

此外, 本研究結(jié)果顯示: 在平板光生物反應(yīng)器中, 全氮條件下培養(yǎng)的細(xì)胞油脂含量差異不大(圖2C), 這主要可能是由于光徑變化范圍在1.5—5.0 cm,此時(shí)的光強(qiáng)[單側(cè)300 μmol /(m2·s)]未能明顯對(duì)藻產(chǎn)生脅迫作用; 當(dāng)然, 可能也與此條件下的培養(yǎng)的時(shí)間有關(guān), 若適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)周期, 油脂積累規(guī)律則必會(huì)更加清晰。同樣, 在低氮條件下的結(jié)果恰好也驗(yàn)證了這一點(diǎn): 在3種光徑下培養(yǎng)的油脂含量均因?yàn)榈獫舛冉档投@著增大, 但最大油脂含量之間無(wú)顯著差異(圖2D)。這也說(shuō)明在低氮條件下, 1.5—5.0 cm光徑的變化并不是影響油脂積累的最主要因素, 而是氮濃度。據(jù)此, 我們可以考慮增大光強(qiáng)(或者雙側(cè)光照), 進(jìn)一步減小光徑, 則定會(huì)有更高的油脂含量與單位體積產(chǎn)率。

光徑對(duì)藻細(xì)胞的生化組成也有十分顯著的影響, 其中, 對(duì)于AA的積累, 則與生物量和油脂的規(guī)律有所不同。在本研究中, 全氮條件下的AA含量差別不大, 而低氮條件下, 光徑越小, 則越不利于AA的積累(圖3)。這和Zhang等[18]對(duì)缺刻緣綠藻的研究結(jié)果一致, 即在1.0 cm光徑條件下的AA含量顯著低于3.0 cm光徑條件下的AA含量。這均是因?yàn)樵诘偷獥l件下, 光徑過(guò)小引起的光強(qiáng)過(guò)強(qiáng), 已經(jīng)不利于細(xì)胞AA的積累[22]; 因此窄光徑低氮培養(yǎng)時(shí), 可采取增大初始細(xì)胞接種密度的辦法, 提高細(xì)胞AA含量。另外, 我們認(rèn)為這也與測(cè)定細(xì)胞AA含量的時(shí)期有一定關(guān)系。因?yàn)橛邢嚓P(guān)研究指出AA含量通常是在對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定前期達(dá)到最大, 因此窄光徑低氮培養(yǎng)下的藻細(xì)胞若能提前收獲, AA的產(chǎn)率可能會(huì)更高[37,38]。但是, 我們?nèi)裟芨鶕?jù)光徑, 通過(guò)改變氮濃度(例如, 在窄光徑條件下, 我們可以適當(dāng)提高氮濃度), 實(shí)現(xiàn)生物量和AA含量均顯著升高,這樣才能大幅提高AA產(chǎn)率。

光徑及氮濃度均顯著影響缺刻緣綠藻的生長(zhǎng)、油脂及AA積累。其中, 窄光徑或者高氮濃度有利于缺刻緣綠藻的生長(zhǎng), 而不利于AA的積累。因此, 根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要, 在確定的氮濃度條件下選擇合適的光徑, 這對(duì)于平衡好成本與產(chǎn)率的關(guān)系暨規(guī)模化培養(yǎng)缺刻緣綠藻生產(chǎn)AA均具有十分重要的意義。

圖5 光徑及氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻第14天花生四烯酸(AA)單位體積和面積產(chǎn)率的影響Fig. 5 Arachidonic acid (AA) volumetric and areal productivity of Parietochloris incisa in different light-path and nitrogen concentration