基于葉綠素?zé)晒馓接戞溍顾貙δ钪樵迳L及光合毒性效應(yīng)

張紅波 董聰聰 楊燕君 付君珂 劉 黎 賀新宇 施軍瓊 吳忠興

(西南大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室, 重慶市三峽庫區(qū)植物生態(tài)與資源重點實驗室, 重慶 400715)

抗生素是一種天然和半合成的化合物, 可以抑制或消除微生物(例如細菌、真菌或原生動物)的生長[1]。隨著農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 抗生素在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等中都發(fā)揮著重要作用[2]。然而, 由于抗生素的大量使用, 過期抗生素藥品處理不當(dāng)及含抗生素污水處理不完全等原因, 導(dǎo)致大量抗生素藥物不斷地排放到水環(huán)境中, 其對環(huán)境安全、生態(tài)系統(tǒng)及人類健康的威脅越來越嚴(yán)重[3,4]。有報道, 目前水中檢測到的抗生素有50余種, 不同的抗生素在水中的殘留量從ng/L到μg/L不等[5,6]。Wei等[6]調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)江蘇省大型禽畜養(yǎng)殖場廢水中磺胺甲嘧啶、氧四環(huán)素、四環(huán)素和磺胺甲惡唑檢測到的最大濃度分別為211、72.9、10.3和 63.6 μg/L。因此, 抗生素已被認為是一類新興的環(huán)境污染物[7]。

鏈霉素是從灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)分離的氨基糖苷類物質(zhì), 通過干擾氨酰-tRNA與核糖體的結(jié)合, 導(dǎo)致遺傳密碼錯讀, 抑制mRNA翻譯起始和異常校對的一類抗生素[8]。因此, 其被廣泛用于人類和獸醫(yī)學(xué)的預(yù)防和治療, 并作為植物檢疫劑[9]。在美國, 鏈霉素被廣泛應(yīng)用于控制水果、蔬菜、種子、普通作物以及觀賞作物的細菌和真菌疾病, 并作為觀賞池塘和水族館微藻生長的殺菌、抑菌的抗生素[10]。沈洪艷等[11]發(fā)現(xiàn)鏈霉素暴露對錦鯉魚體會造成暫時性損傷, 但最終會恢復(fù)到正常水平。王麗新[12]研究表明SOD、GSH、GSH-PX和MDA可作為評估鏈霉素廢水對于斑馬魚污染脅迫的敏感生物標(biāo)志物。

浮游植物是水生環(huán)境中營養(yǎng)鏈中的第一個環(huán)節(jié), 其生長、組成的變化將影響水生生態(tài)系統(tǒng)[13]。張磊等[14]研究表明, 鏈霉素明顯抑制了蛋白核小球藻的光合放氧, 對藻細胞產(chǎn)氫后期的生長也有一定抑制作用。Qian等[13]研究表明銅綠微囊藻對鏈霉素比小球藻更敏感。然而, 這些研究主要探討鏈霉素對藻類的生長及抗氧化酶活性的影響, 卻很少從光合角度去關(guān)注其毒性效應(yīng)的機制。Strasser和Strasser[15]在基于生物膜能量流動基礎(chǔ)上建立了針對快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的數(shù)據(jù)分析和處理方法-JIP-測定(JIP-test), 為深入研究光合作用原初反應(yīng)提供了有力而便捷的工具。

念珠藻(Nostoc)屬于藍藻門、念珠藻目、念珠藻科、念珠藻屬。其分布范圍很廣, 陸地和水中均有分布, 是一種水體常見的、廣譜性的代表種類。由于其獲取容易, 且分布范圍廣泛, 所以念珠藻是一種研究毒素生態(tài)效應(yīng)的理想材料。因此, 為了探討鏈霉素對藻類毒性效應(yīng)機制, 本研究以利用Handy-PEA分析了不同鏈霉素濃度培養(yǎng)下念珠藻的生長及光合系統(tǒng)葉綠素?zé)晒馓匦? 旨在從光合角度去揭示鏈霉素對藻類的毒性效應(yīng), 并為探討抗生素對水生生態(tài)系統(tǒng)影響提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

念珠藻(Nostocsp. FACHB-95)由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供。在藻種置光照培養(yǎng)箱中, 以MA培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)[16], 培養(yǎng)溫度(25±0.1)℃, 光照為36 μmol/(m2·s)、光暗比為12h∶12h。

1.2 實驗設(shè)計

將培養(yǎng)至指數(shù)生長期藻種離心后, 分別接入含有250 mL的錐形瓶中, 接種OD為0.115左右。以滅菌后的MA培養(yǎng)基配置鏈霉素(純度大于99%, 生工生物工程(上海)股份有限公司)母液, 然后參考環(huán)境當(dāng)中抗生素含量及前期預(yù)實驗, 將培養(yǎng)基配制成0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L的5個濃度。每個濃度組設(shè)置3個重復(fù), 以不含鏈霉素的MA培養(yǎng)基作為空白對照。培養(yǎng)條件與藻種培養(yǎng)相同, 每天定時搖動3次, 使藻細胞充分與培養(yǎng)液接觸。

1.3 葉綠素a及EC50測定

葉綠素a的測定采用90%丙酮于黑暗中抽提24h, 離心后的上清液通過分光光度度計測定630、647、664和750的吸收值[17]。比生長速率的計算參照xiang等的方法[18], 96h半致死濃度(96h-EC50)采用概率單位法(Probit method)進行計算[19]。

1.4 葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線及葉綠素?zé)晒鈪?shù)

取2 mL藻液, 置黑暗處適應(yīng)25min后, 用便攜式植物效率分析儀(Handy-PEA, 英國漢莎公司)測定不同濃度鏈霉素處理后的念珠藻多相葉綠素?zé)晒庾兓?。測定時光化光為3000 μmol quanta/(m2.s), 收集10μs至2s的熒光信息。并通過JIP-測定獲得相關(guān)熒光參數(shù)(表1)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用Excel進行處理, 使用SPSS 22對所有數(shù)據(jù)均進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。當(dāng)P＜0.05, 差異顯著性,P＜0.01, 差異極顯著性。所有圖形均用Origin 8.6進行。

2 結(jié)果

2.1 葉綠素含量、比生長速率及EC50值

在0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L濃度的鏈霉素處理下培養(yǎng)至96h, 葉綠素含量與對照組相比分別下降了23.79%、42.80%、71.15%、80.99%和80.23%, 且與對照組均有極顯著差異(P＜0.01, 圖1A)。比生長速率隨鏈霉素濃度升高而下降, 當(dāng)鏈霉素濃度高于為0.05 mg/L時, 比生長速率被顯著抑制(P＜0.05), 當(dāng)鏈霉素濃度大于0.1 mg/L時, 念珠藻生長完全被抑制, 比生長速率為負值(圖1B)。通過SPSS計算得到念珠藻暴露于鏈霉素中96h的EC50值(96h-EC50)為(0.13±0.037) mg/L。

2.2 葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線

在不同濃度的鏈霉素處理后, 各濃度下念珠藻的熒光動力學(xué)曲線如圖2。低濃度(≤0.1 mg/L)的相對熒光動力學(xué)曲線與對照組無顯著差異。而當(dāng)濃度高于0.1 mg/L的相對熒光曲線發(fā)生了顯著的變化, J點消失, 并出現(xiàn)了明顯的K點, K點的相對熒光值隨鏈霉素濃度的升高的增大。

2.3 葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)(JIP-test)

可變熒光(Fv)、光系統(tǒng)Ⅱ(SPⅡ)的潛在活性(Fv/F0)、光系統(tǒng)Ⅱ(SPⅡ)最大光化學(xué)效率(φP0)、用于電子傳遞的量子產(chǎn)額(φE0)、以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)(PIabs)和單位面積上有活性的反應(yīng)中心的數(shù)目(RC/CS0)均隨鏈霉素濃度的升高而顯著下降, 且與對照組均呈現(xiàn)出極顯著的差異(P＜0.01,圖3A、3B)。然而, 單位葉綠素最大熒光產(chǎn)量(Fm/Chl.a)、單位反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)和反應(yīng)中心的熱耗散(DI0/RC)均隨鏈霉素濃度的升高而增加, 當(dāng)鏈霉素濃度大于0.1 mg/L時, 與對照組有極顯著的差異(P＞0.01, 圖3B)。

圖1 不同鏈霉素濃度處理下念珠藻的葉綠素含量(A)和比生長速率(B)Fig. 1 The effects of different concentrations of streptomycin on chlorophyll a content (A) and the growth rate (B) of Nostoc.

圖2 念珠藻快速葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線Fig. 2 The fast fluorescence transient curve of Nostoc

3 討論

3.1 鏈霉素對念珠藻生長及葉綠素a的影響

抗生素作為常用的藥物之一, 由于大量的使用,導(dǎo)致其不斷地進入水體環(huán)境中, 造成了極大的環(huán)境生態(tài)風(fēng)險[21]。先前研究表明, 銅綠微囊藻和小球藻暴露在鏈霉素中96h后的EC50分別為0.28和20.08 mg/L[13]。本研究表明在鏈霉素處理96h時, 念珠藻EC50值為(0.13±0.037) mg/L, 與藍藻銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)差異不大, 比綠藻小球藻(Chlorella pyrenoidosa)更加敏感。Freyssinet[22]發(fā)現(xiàn)鏈霉素主要與葉綠體核糖體結(jié)合, 而與細胞質(zhì)核糖體結(jié)合很少, 進而影響蛋白質(zhì)進入葉綠體的合成。本文研究發(fā)現(xiàn), 在各鏈霉素濃度培養(yǎng)96h, 葉綠素a含量與對照組相比明顯下降(圖1A), 然而單位細胞葉綠素含量并未表現(xiàn)出顯著的差異。Reid等[23]發(fā)現(xiàn)小球藻暴露于鏈霉素中, 引起的生長減少是由于小球藻二氧化碳固定受到抑制, 導(dǎo)致生長降低。本研究也發(fā)現(xiàn)在鏈霉素處理后, 念珠藻生長受到顯著的抑制, 表明鏈霉素未通過抑制念珠藻葉綠素a的合成導(dǎo)致其生長受到抑制。

3.2 鏈霉素對念珠藻熒光動力學(xué)曲線的影響

Bj?rkman[24]研究表明葉綠素含量的減少反映了光反應(yīng)中心復(fù)合體天線色素減少, 暗示在鏈霉素處理后, 念珠藻的光系統(tǒng)可能發(fā)生損傷。本研究發(fā)現(xiàn)低濃度(≤0.1 mg/L)處理, 念珠藻相對熒光動力學(xué)曲線與對照組幾乎無顯著差異, 而濃度高于0.1 mg/L時相對熒光曲線出現(xiàn)了明顯的K點(圖2)。研究表明, 當(dāng)PSⅡ的供體側(cè)受到脅迫時, 在極短的時間內(nèi)(在J點之前), 葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量就會上升, 出現(xiàn)K點(光照后大約300 μs處的特征位點)[20,25]。K點的出現(xiàn)是由于水裂解系統(tǒng)受到抑制和QA之前的受體側(cè)部分被抑制所造成, 導(dǎo)致了放氧復(fù)合體(OEC)受到損害, 因此放氧復(fù)合體往往被作為OEC被傷害的一個特殊標(biāo)記[26,27]。念珠藻在高濃度鏈霉素處理后出現(xiàn)了明顯的K點, 表明在鏈霉素處理后念珠藻PSⅡ受體側(cè)受到傷害, 導(dǎo)致了OEC損傷發(fā)生。

圖3 在不同鏈霉素處理下念珠藻的熒光參數(shù)與對照組的百分比Fig. 3 The effects of streptomycin to the fluorescence parameters of Nostoc

3.3 鏈霉素對念珠藻光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)熒光動力學(xué)參數(shù)的影響

PSⅡ反應(yīng)中心結(jié)構(gòu)的改變, 導(dǎo)致不參與電子傳遞的封閉反應(yīng)中心的數(shù)量增加, 進而導(dǎo)致了Fv的降低[28]。因此,Fv的降低通常被認為是光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)供體側(cè)的電子傳遞被抑制的一種表征[29]。本研究發(fā)現(xiàn)Fv隨著鏈霉素的增加和降低(圖3A), 進一步表明了念珠藻的供體側(cè)電子傳遞被抑制, 這也可能與復(fù)合天線中葉綠素濃度的降低或放氧發(fā)生復(fù)合物活性的降低有關(guān)[30]。在正常條件下, 有活性的PSⅡ反應(yīng)中心將捕獲的光能轉(zhuǎn)化為激發(fā)能, 并將其中的一部分轉(zhuǎn)化為化學(xué)能, 推動碳同化反應(yīng), 其余部分耗散掉。然而, 在某些脅迫下, 光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng)中心發(fā)生可能部分失活, 能吸收光能但不能推動電子傳遞[27]。本研究發(fā)現(xiàn), 單位面積上有活性反應(yīng)中心(RC/CS0)在鏈霉素處理后顯著低于對照組(圖3B), 說明鏈霉素導(dǎo)致了念珠藻光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng)中心失活或降解。PIabs在一定程度上反映了脅迫對光合結(jié)構(gòu)的破壞[20]。研究已表明高等植物在受到某些脅迫時, 光合機構(gòu)被破壞,PIabs會顯著下降[20,31,32]。在本研究中, 隨著培養(yǎng)基中鏈霉素濃度的增加, 吸收性能指標(biāo)(PIabs)顯著降低(P＜0.05), 且高濃度(≥0.2 mg/L)的PIabs為0(圖3B), 表明念珠藻的光合機構(gòu)受到極大破壞, 光合效率大幅度下降。φP0表示電子傳遞的能量占有活性反應(yīng)中心捕獲的能量的比例, 也反映了PSⅡ最大光化學(xué)效率。φE0表示捕獲的光能把電子傳遞到電子傳遞鏈中超過的電子受體的概率, 在鏈霉素處理下, 念珠藻φP0和φE0均顯著低于對照組(圖3B),表明鏈霉素降低了念珠藻光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)用于電子傳遞的能量, 且較多的光能用于還原QA, 導(dǎo)致了念珠藻初級光反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)被抑制, 進而阻斷了電子從流向光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)。

綜上所述, 高濃度鏈霉素處理, 念珠藻光合結(jié)構(gòu)遭到破壞, 單位面積上有活性的反應(yīng)中心數(shù)量減少, 光系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞受阻, 抑制了光合作用, 導(dǎo)致念珠藻生長受阻。隨著水體抗生素的污染加劇, 探討抗生素的生態(tài)毒理效應(yīng)尤為重要。然而, 關(guān)于抗生素對藻類影響的研究相對較少, 因此, 抗生素對藻類的毒性效應(yīng)研究仍需要開展大量的工作。