Tollip在左前降支結(jié)扎的心肌梗死小鼠模型心肌細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制

周姝 卜法芹 常巧玉 陳紅偉 趙舒才 李娜 韓紅強(qiáng) 王巖

(1新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院心內(nèi)二科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2河南醫(yī)學(xué)組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院3 CCU；4 彩超室)

Tollip是一種內(nèi)源性的Toll樣受體家族抑制劑，表達(dá)于心臟且在心臟發(fā)育調(diào)控中具有重要作用。Tollip可抑制壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚，表明Tollip可能與心臟疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但針對(duì)Tollip在急性心肌梗死(AMI)中的作用研究目前國(guó)內(nèi)外暫無(wú)報(bào)道〔1,2〕。為探索Tollip在AMI中的作用及其相關(guān)機(jī)制，本文利用轉(zhuǎn)基因小鼠建立AMI動(dòng)物模型，并通過(guò)分析心臟相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能方面的參數(shù)來(lái)解釋Tollip基因?qū)MI進(jìn)程的影響。

1 材料與方法

1.1材料 主要試劑：牛血清白蛋白(BSA，貨號(hào)10735078001，Roche)；苯甲基磺酰氟(PMSF，貨號(hào)P7626，Sigma)；聚山梨酯-20(Tween-20，貨號(hào)0777，Amresco)；3-(N-嗎啡基)丙磺酸(MOPS，貨號(hào)0670，Amresco)；二硫蘇糖醇(DTT，貨號(hào)D8220，Solarbio)；釩酸鈉(Na3VO4，貨號(hào)A1302，Amresco)；十二烷基硫酸鈉(SDS，貨號(hào)0227，Amresco)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒，貨號(hào)23225，Thermo；乙二胺四乙酸(EDTA，貨號(hào)10009617，國(guó)藥)；三羥甲基氨基甲烷(Tris-Base，貨號(hào)XK0531LA01，飛羿科技)；Tollip，貨號(hào)SC27315，Santa Cruz；驢抗山羊IgG(H+L)，貨號(hào)705-035-003，Jackson；山羊抗兔IgG(H+L)，貨號(hào)115-035-003，Jackson；山羊抗兔IgG(H+L)，貨號(hào)111-035-003，Jackson；耦合劑，貨號(hào)TM-100，天津成信；戊巴比妥鈉，貨號(hào)P3761，Sigma；異氟烷，貨號(hào)120201，山東科源制藥有限公司；磷鉬酸，貨號(hào)20029916，上海國(guó)藥；氯化鉀，貨號(hào)831476，上海強(qiáng)順；蘇木素，BA4021，珠海貝索；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。相關(guān)引物均購(gòu)自CST。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：采用C57BL/6(WT)遺傳背景，8～9 周齡成年、雄性、體重為23～28 g的小鼠和C57BL/6遺傳背景的雄性轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠手術(shù)建立經(jīng)典的AMI小鼠動(dòng)物模型。心臟特異性α-MHC-Tollip轉(zhuǎn)基因小鼠獲得方法：將心臟特異性α-MHC-Tollip轉(zhuǎn)基因構(gòu)建子使用顯微注射技術(shù)送至雌性小鼠胚胎中(外送)。實(shí)驗(yàn)分為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?NTG-Sham)組(非轉(zhuǎn)基因小鼠，n=12)；轉(zhuǎn)基因?qū)φ?TG-Sham)組(轉(zhuǎn)基因小鼠，n=16)；非轉(zhuǎn)基因AMI(NTG-MI)組(非轉(zhuǎn)基因小鼠，n=31)；轉(zhuǎn)基因AMI(TG-MI)組(轉(zhuǎn)基因小鼠，n=53)。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建AMI模型 3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(注意回抽)，至夾尾或夾趾反應(yīng)不顯著則表示麻醉狀態(tài)良好。用小鼠專用的動(dòng)物剃毛器輕柔剔除左側(cè)胸前區(qū)及左腋下的毛發(fā)，并用生理鹽水紗布擦凈。其余步驟參考文獻(xiàn)方法〔3〕進(jìn)行。術(shù)后每日觀察小鼠的活動(dòng)狀態(tài)及個(gè)體存活情況，若發(fā)現(xiàn)死亡，查明原因并做好詳細(xì)的記錄。對(duì)照組：僅在前降支處穿過(guò)一條短縫線，即掛線不結(jié)扎。

1.2.2心臟超聲(Echo)及血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 分別在二維模式(B-MODE)和M型模式下，測(cè)量以下數(shù)據(jù)：左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF%)、短軸縮短率(FS%)。事先連接好信號(hào)采集處理系統(tǒng)，并打開(kāi)電腦相關(guān)程序。碘伏溶液仔細(xì)消毒小鼠頸部處的皮膚，并用眼科剪將其剪開(kāi)，在顯微鏡視野下小心的鈍性分離組織并游離出右側(cè)頸動(dòng)脈，將 Millarl1.4F 超微導(dǎo)管沿右頸動(dòng)脈插至左心室(注意保持頸部傷口濕潤(rùn))。待波形穩(wěn)定后，測(cè)定左室最大壓力上升速率(Vmax)、左室最小壓力上升速率(Vmin)。

1.2.3取材及染色 動(dòng)態(tài)稱量法稱量小鼠體重(BW)，然后以過(guò)量麻醉法迅速處死小鼠。從10%中性甲醛固定液中取出心臟標(biāo)本，沿橫斷面切去心底部約1/3的部分(包括左、右心耳及雙心房)，將剩余2/3部分心底朝下放入包埋框中，流水沖洗至少30 min。動(dòng)作需細(xì)致輕柔，以免力度過(guò)大破壞心臟組織結(jié)構(gòu)。將蠟塊放入脫水機(jī)中并設(shè)定相關(guān)脫水參數(shù)及程序。將標(biāo)本放入預(yù)先溶解的石蠟中，在包埋機(jī)上進(jìn)行心臟石蠟包埋。將事先冷凍的蠟塊固定于切片機(jī)上，調(diào)整刀口并將切片厚度設(shè)置為5 μm進(jìn)行修片并連續(xù)切片。將石蠟切片擺放在染色架上，置于烘箱內(nèi)烘烤15～30 min，使組織切片緊貼于載玻片上，最后將切片收入切片盒中備用，之后按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫熒光(IF)染色。普通光學(xué)顯微鏡10倍下拍照，通過(guò)IPP6.0圖像處理軟件分析梗死面積。梗死面積比例=(梗死區(qū)面積/左心室心肌面積)×100%。

1.2.4病毒感染及染色 感染前做目的細(xì)胞感染預(yù)實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞不受明顯傷害和熒光表達(dá)正常的情況下，確定病毒的最佳加入量。根據(jù)細(xì)胞類型和分析時(shí)間，感染前1天，接種細(xì)胞至6孔板，使第2天感染時(shí)細(xì)胞密度為60%～70%。用培養(yǎng)基稀釋病毒原液，終體積為400 μl，直接加入6孔板中，使細(xì)胞接種于37℃，5%CO2狀態(tài)下。24 h之后將稀釋病毒液替換成含有血清的培養(yǎng)基，常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。將培養(yǎng)好且感染病毒的原代心肌細(xì)胞于常溫下常氧或缺氧處理24 h。用4%的多聚甲醛于37℃固定約15 min。吸去固定液并用事先預(yù)溫的磷酸鹽緩沖液(PBS)稍洗，加Hoechst33258染色液，37℃染色10 min。吸去Hoechst33258染色液，預(yù)溫PBS洗1次后加碘化丙啶(PI)染液，4℃染色10 min。吸去PI染液，用預(yù)溫過(guò)的PBS洗1次后用甘油進(jìn)行封片。對(duì)細(xì)胞中Mac-1、LY6G、CD3表達(dá)情況進(jìn)行熒光拍照。

1.2.5Western印跡法 Western印跡檢測(cè)Bax、Bcl-2、活化的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)3、Caspase3、磷酸化(p)-蛋白激酶B(Akt)、p-mTOP、p-GSK3β、p-S6、p-叉頭框蛋白(FOX)O1蛋白表達(dá)，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，孵育結(jié)束后用TBST洗滌5 min×3次。將A液、B液混合后適量滴至膜上目的條帶位置，將膜置于Flour Chem Eimager或Bio-Rad Chemi Doc XRS中曝光，檢測(cè)目的條帶。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組心功能和梗死面積比較 與NTG-MI組〔(11.12±0.98)%〕相比，TG-MI組心臟梗死面積顯著擴(kuò)大〔(15.23±1.12)%，P<0.05〕，LVEF、FS、Vmax、Vmin顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

2.2Tollip對(duì)AMI小鼠炎癥反應(yīng)的影響 與NTG-MI組相比較，TG-MI組Mac-1〔(10.2±1.5)% vs (25.5±2.3)%〕、LY6G〔(10.5±1.2)% vs (26.4±2.1)%〕、CD3〔(11.2±1.0)% vs (23.3±2.5)%〕陽(yáng)性率明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3Tollip對(duì)AMI小鼠凋亡的影響 與NTG-MI組相比較，TG-MI組抗凋亡基因Bcl-2、Cacpase3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，促凋亡基因Bax、Cleaved-Cacpase3蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖3。

2.4Tollip對(duì)AMI影響的可能機(jī)制 與NTG-MI組相比，TG-MI組p-MEK1/2，p-ERK1/2，p-JNK1/2，p-P38水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與NTG-MI組相比，TG-MI組p-Akt、p-mTOR、p-GSK3β、p-S6和p-FOXO1水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表2。

表1 各組心功能及Bcl-2、Caspase 3、Bax、Cleaved Caspase 3蛋白水平比較

與NTG-Sham組相比：1)P<0.05；與NTG-MI組相比：2)P<0.05

圖1 各組梗死面積(HE，×200)

圖2 各組Mac-1、LY6G、CD3熒光染色圖(×200)

圖3 Western印跡檢測(cè)各組凋亡相關(guān)蛋白水平

圖4 MAPK及Akt信號(hào)通路檢測(cè)結(jié)果

表2 MAPK及Akt信號(hào)通路檢測(cè)結(jié)果

與NTG-MI組相比：1)P<0.05

3 討 論

AMI的并發(fā)癥包括乳頭肌功能不全或發(fā)生斷裂、心室或心臟破裂、心室壁瘤、栓塞、AMI后綜合征等。其中心臟破裂又分為游離壁、室間隔和乳頭肌破裂3種。盡管有經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)及外科手術(shù)的技術(shù)進(jìn)步，但是心臟破裂依舊是導(dǎo)致AMI住院死亡率的重要原因之一。心臟破裂有許多獨(dú)立的危險(xiǎn)因素如女性、年齡大、低血壓、快心率、延遲溶栓及血栓形成等等。Qian等〔3〕通過(guò)研究證明血紅蛋白和白細(xì)胞計(jì)數(shù)是預(yù)測(cè)心臟破裂的危險(xiǎn)因素。本文結(jié)果提示Tollip可能影響AMI的發(fā)生發(fā)展。AMI發(fā)生后，靶血管供應(yīng)的相應(yīng)心肌組織的收縮和(或)舒張功能會(huì)產(chǎn)生障礙，導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)紊亂。心室尤其是左室的射血功能受到影響將會(huì)明顯降低，使冠狀動(dòng)脈的充盈更加不足而加重AMI的進(jìn)程。Liu等〔4〕研究證明：Tollip負(fù)向調(diào)節(jié)壓力負(fù)荷引起的小鼠心室肥厚，表現(xiàn)為Tollip基因敲除后可加重心肌肥厚、心功能惡化、間質(zhì)纖維化及失代償期的心力衰竭。本研究結(jié)果提示即使是相同的基因在不同疾病狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所發(fā)揮的作用亦是迥異，且在不同的階段所起的作用也可能不一樣，比如在結(jié)腸炎的模型中，Tollip的表達(dá)是上升的〔5〕，而在結(jié)腸癌的疾病模型中，Tollip在其中的表達(dá)是下降的〔6〕。心肌細(xì)胞的凋亡可發(fā)生在AMI的急性期并持續(xù)數(shù)月。心肌細(xì)胞凋亡可直接影響心臟的功能，增加AMI死亡率，而有效的抑制心肌細(xì)胞凋亡則可顯著縮小AMI范圍。本文顯示：Tollip過(guò)表達(dá)加重心肌細(xì)胞凋亡并活化凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，表現(xiàn)為Bcl-2、Cacpase3蛋白水平降低，Bax、Cleaved Cacpase3蛋白水平升高。

MAPK參與并調(diào)節(jié)在心肌梗死病理發(fā)生中的炎癥和凋亡反應(yīng)，這種調(diào)節(jié)主要是借助刺激之后3個(gè)重要的亞家族的活化或抑制，即ERK、JNK、p38〔7〕。MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)也參與心肌缺損傷的調(diào)節(jié)，但本文并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Tollip對(duì)MAPK通路有意義的影響。研究證明Tollip并不能抑制胚胎成纖維細(xì)胞中脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的MAPK的激活，這與本文結(jié)果相似〔8，9〕。PI3K/Akt/mTOR通路在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著至關(guān)重要的作用，如增殖、黏附、遷移、侵入、能量代謝、蛋白質(zhì)合成等。而Akt信號(hào)通路被認(rèn)為是一個(gè)參與心肌梗死病理過(guò)程且行之有效的的促生存信號(hào)通路〔10〕。Akt是許多內(nèi)源性分子調(diào)節(jié)心肌缺血損傷的共同介質(zhì)，如胰島素、胰島素生長(zhǎng)因子1和網(wǎng)膜素等。Zhang等〔11〕研究證明七氟烷預(yù)適應(yīng)后的心臟即可通過(guò)活化PI3K/Akt/mTOR通路而發(fā)揮保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的作用。本文結(jié)果顯示，Tollip可抑制Akt信號(hào)通路，表明Tollip在缺血性心臟的作用與Akt通路有關(guān)。由此可看出Tollip對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的作用是有選擇性的。

本文采用Western印跡法測(cè)定Tollip基因過(guò)表達(dá)對(duì)心肌梗死小鼠術(shù)后4 w的Akt/GSK3β/FOXO1軸中各成員的總蛋白和磷酸化蛋白的水平，旨在初步探討Tollip在對(duì)心肌梗死產(chǎn)生影響的可能機(jī)制。本文結(jié)果表明：與非轉(zhuǎn)基因AMI組相比較，Tollip轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)AMI術(shù)后4 w Akt、mTOR、GSK3β、S6與FOXO1的磷酸化水平下降，總蛋白水平無(wú)差異。Akt通路的激活產(chǎn)生抑制凋亡的效應(yīng)，這與本文Tollip基因敲除后相關(guān)促凋亡蛋白水平降低結(jié)果相符。由此推測(cè)，Tollip發(fā)揮的AMI后抗凋亡效應(yīng)主要(至少部分)是通過(guò)Akt活化所介導(dǎo)的抗凋亡作用而實(shí)現(xiàn)的。盡管基因小鼠表現(xiàn)出了內(nèi)源性的Tollip基因在缺血性心肌病中強(qiáng)大作用，但是基因干預(yù)治療仍然是臨床應(yīng)用的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)〔12，13〕。因此，從臨床的角度來(lái)看，探索Tollip在心臟中的作用或通過(guò)Akt活化實(shí)現(xiàn)還需從藥理方面著手。鑒于Tollip在AMI和心肌肥厚小鼠模型中發(fā)揮相反的作用〔14，15〕，今后的研究應(yīng)將重點(diǎn)放在挽救缺血性損傷同時(shí)又不會(huì)加重心肌肥厚方面。

綜上所述，Tollip過(guò)表達(dá)使小鼠AMI面積擴(kuò)大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，心肌細(xì)胞凋亡加劇，心臟功能惡化。提示Tollip與心肌梗死的進(jìn)展密切相關(guān)。Tollip基因過(guò)表達(dá)后Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的Akt、mTOR、GSK3β、S6和FOXO1的磷酸化水平降低。這一研究結(jié)果提示Tollip在AMI中所發(fā)揮的作用可能是通過(guò)介導(dǎo)Akt通路實(shí)現(xiàn)的。Tollip主要通過(guò)(至少部分)介導(dǎo)Akt信號(hào)通路促進(jìn)AMI后的炎癥和凋亡反應(yīng)，導(dǎo)致AMI死亡率增加、梗死面積增大，心功能惡化。此結(jié)論提示抑制Tollip的表達(dá)也許可成為未來(lái)臨床治療的靶點(diǎn)或藥物研究方向。