Bradford定量法在蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)化研究

崔為同, 薛華儒, 成洪達(dá), 張海濱, 王清路

齊魯醫(yī)藥學(xué)院, 山東省生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 淄博 255300

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)已成為生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[1,2]。雙向電泳(2-DE)技術(shù)可根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量同時(shí)分離多達(dá)幾千種蛋白質(zhì)，因此被廣泛應(yīng)用于比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[3]。為保證分析的公正和可靠性，等電聚焦電泳時(shí)配對(duì)分析的兩組蛋白質(zhì)樣品的加樣量應(yīng)嚴(yán)格一致。這就要求在電泳之前需要對(duì)不同樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。定量準(zhǔn)確性不但影響后續(xù)蛋白質(zhì)圖譜分析，而且關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性[4～6]。

為使蛋白質(zhì)變性并提高蛋白質(zhì)的溶解度，溶解蛋白質(zhì)樣品的裂解液(lysis)中含有高濃度的變性劑、表面活性劑、還原劑和兩性電解質(zhì)等成分，這些成分對(duì)常用蛋白質(zhì)定量方法都存在干擾[7]。已有研究者關(guān)注lysis干擾蛋白質(zhì)定量的問(wèn)題，但尚未發(fā)現(xiàn)完全兼容lysis的定量方法[7～9]。Lysis干擾導(dǎo)致蛋白質(zhì)定量不準(zhǔn)確可能是現(xiàn)有文獻(xiàn)中使用相同實(shí)驗(yàn)材料和同規(guī)格膠條，但加樣量存在較大差異的主要原因[10,11]。已有研究分析了Bradford法[12]、二喹啉甲酸(BCA)法[13]和Folin-酚(Lowry)法[14]等三種常用定量方法對(duì)2-DE樣品的適用性，發(fā)現(xiàn)lysis組分對(duì)三種方法都有干擾，但Bradford法對(duì)lysis的兼容性最好[7,9]。

Bradford法具有成本低、靈敏度高和測(cè)定快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)定量方法之一[15,16]。雖然該法在測(cè)定2-DE樣品時(shí)較其他定量方法有一定優(yōu)勢(shì)[7]，但仍存在lysis會(huì)產(chǎn)生背景干擾的問(wèn)題[17]，而且lysis可能會(huì)影響蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的穩(wěn)定性，但目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。另外，Bradford在首次報(bào)道該方法時(shí)沒(méi)有明確闡述該法的線性范圍[12]，現(xiàn)有文獻(xiàn)資料中對(duì)Bradford法線性范圍的描述也不一致[18,19]。

為使Bradford法更適合在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用，本研究針對(duì)目前應(yīng)用該法定量2-DE樣品時(shí)存在的問(wèn)題，對(duì)該法的線性范圍、lysis組分、測(cè)定時(shí)間、顯色液中磷酸含量、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以及加樣體積等進(jìn)行了優(yōu)化。這些優(yōu)化可使Bradford法更適合定量蛋白質(zhì)組學(xué)樣品，從而獲得更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。同時(shí)可規(guī)范定量操作，盡量減小不同實(shí)驗(yàn)者之間定量數(shù)據(jù)的差異性，使定量數(shù)據(jù)有較高的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥品和試劑 牛血清白蛋白(BSA)(購(gòu)自Roche公司)、尿素和硫脲(購(gòu)自Sigma公司)、兩性電解質(zhì)Pharmalyte (pH 3～10)(購(gòu)自GE Healthcare公司)、考馬斯亮藍(lán)G-250(購(gòu)自Amresco公司)、二硫蘇糖醇(DTT)(購(gòu)自Merck公司)、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)(購(gòu)自Promega公司)、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)(購(gòu)自Fluka公司)和聚乙二醇單辛基苯基醚(Triton X-100)(購(gòu)自Amresco公司)，所用藥品均為分析純。試劑配制用水均為蒸餾水。

以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度用比色法校正，即用紫外分光光度計(jì)和1 cm光徑的石英比色杯測(cè)定1 mg/mL BSA溶液時(shí)，在280nm處的吸光度應(yīng)為0.66[20]。該標(biāo)準(zhǔn)液分裝后保存于-20℃的冰箱中。

顯色液參考Bradford法[12]，略作改動(dòng)。具體為稱取100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250，加入50 mL 95%乙醇中。CBB-G250充分溶解后，再向其中加入120 mL 85%(w/V)的磷酸[21]，混勻后用蒸餾水定容至1 L并過(guò)濾。濾液用棕色瓶室溫保存。

本研究采用常規(guī)的尿素/硫脲裂解液[22]，含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(w/V)CHAPS、2% (V/V) Pharmalyte (pH 3～10)、1% (w/V) DTT(現(xiàn)用現(xiàn)加)。配制完成后分裝到Eppendorf管中，-20℃冰箱保存。

1.1.2儀器 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-1800(日本島津)。

1.2 方法

1.2.1Bradford法線性范圍的確定 用BSA標(biāo)準(zhǔn)液分別配制含0～1 000 μg和0～200 μg標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的樣品， 0～1 000 μg范圍內(nèi)各樣品濃度依次為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0 mg/mL、7.0 mg/mL、8.0 mg/mL、9.0 mg/mL和10.0 mg/mL；0～200 μg范圍內(nèi)各樣品濃度依次為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL 和2.0 mg/mL。測(cè)定吸光度時(shí)以上各樣品均取100 μL，對(duì)照樣品均為100 μL水(以對(duì)照樣品和5 mL顯色液的混合液進(jìn)行儀器調(diào)零，下同)。按Bradford法[12]測(cè)量各樣品在595 nm處對(duì)應(yīng)的吸光度值(A595)。測(cè)定時(shí)與樣品反應(yīng)的顯色液體積均為5 mL，不同濃度樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.2不同體積lysis和不同lysis組分干擾程度的測(cè)定 首先，分別配制含10 μL、40 μL、70 μL、100 μL lysis的水溶液，各樣品體積均為100 μL，以100 μL水為對(duì)照樣品，測(cè)定A595，并計(jì)算相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA的值(μg)。其次，分別用水配制7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4%(w/V) CHAPS、2% (V/V) Pharmalyte (pH 3～10)、1% (w/V) DTT等含lysis單一成分的溶液，各取100 μL加入含5 mL顯色液的試管中，搖勻并反應(yīng)5 min后測(cè)定A595，對(duì)照樣品為100 μL水。再次，分別配制4%的CHAPS、NP-40和Triton X-100溶液。測(cè)定100 μL上述溶液與5 mL顯色液反應(yīng)后的A595，對(duì)照樣品為100 μL水。

1.2.3Lysis對(duì)蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

Bradford最初報(bào)道該方法時(shí)，測(cè)定了0～70 min內(nèi)蛋白質(zhì)-染料反應(yīng)液吸光度的變化，并說(shuō)明顯色反應(yīng)在2 min時(shí)基本完成，A595在1 h內(nèi)變化不會(huì)超過(guò)±4%[12]，即變化幅度在8%左右。Kruger[20]在介紹Bradford法時(shí)也建議在混勻后2～60 min內(nèi)測(cè)定A595。目前尚無(wú)其他文獻(xiàn)報(bào)道Bradford法的穩(wěn)定性，也沒(méi)有l(wèi)ysis對(duì)蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物穩(wěn)定性影響的報(bào)道。為研究lysis對(duì)蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物穩(wěn)定性的影響，本研究分別測(cè)定了有無(wú)lysis條件下1 h內(nèi)反應(yīng)液A595的變化。

配制0.5 mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)液。測(cè)定無(wú)lysis條件下蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的形成速率及穩(wěn)定性時(shí)，取100 μL該標(biāo)準(zhǔn)液和100 μL水加入含有5 mL顯色液的試管中，搖勻后立即放入分光光度計(jì)中連續(xù)測(cè)定1 h內(nèi)A595的變化，儀器每2 s自動(dòng)記錄吸光度值，對(duì)照樣品為200 μL水。測(cè)定存在lysis條件下蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的形成速率及穩(wěn)定性時(shí)，取100 μL該標(biāo)準(zhǔn)液和100 μL lysis加入含有5 mL顯色液的試管中，搖勻后立即測(cè)定1 h內(nèi)A595的變化，對(duì)照樣品為100 μL水和100 μL lysis的混合液。

1.2.4有無(wú)lysis兩種條件下0～50 μg內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定要考慮加樣體積和測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的濃度范圍。經(jīng)典Bradford方法[12]和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教材中[18]介紹的加樣體積均為100 μL。但2-DE樣品體積越大，由lysis造成的背景干擾越嚴(yán)重，因此可通過(guò)減少加樣體積來(lái)降低樣品中l(wèi)ysis的干擾，但加樣體積過(guò)小又會(huì)導(dǎo)致測(cè)量誤差的增加。

根據(jù)蛋白質(zhì)干粉樣品在lysis中的溶解比例，2-DE樣品中蛋白質(zhì)濃度一般在2～5 μg/μL之間[3,23]。若定量時(shí)加樣體積為100 μL，則樣品中蛋白質(zhì)含量為200～500 μg。為避免定量時(shí)超出線性范圍，在測(cè)定時(shí)需要對(duì)樣品進(jìn)行一系列的稀釋，操作較繁瑣，也浪費(fèi)樣品。綜合考慮lysis干擾程度、測(cè)量誤差和操作便利性，將測(cè)定lysis溶解的蛋白質(zhì)樣品的加樣體積優(yōu)化調(diào)整為10 μL。加樣體積調(diào)整后，則10 μL樣品中約含有20～50 μg蛋白質(zhì)，恰好在Bradford法的線性范圍內(nèi)，無(wú)需稀釋，可直接測(cè)定。

分別用水配制含10 μg、20 μg、30 μg、40 μg、50 μg BSA的10 μL和100 μL標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品體系。測(cè)定10 μL lysis對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響時(shí)，向10 μL標(biāo)準(zhǔn)樣品體系中和對(duì)照樣品(10 μL水)各加入10 μL lysis；將各樣品加入5 mL顯色液中，反應(yīng)完全后測(cè)定A595。測(cè)定100 μL lysis對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響時(shí)，向100 μL標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品體系和對(duì)照樣品(100 μL水)中各加入100 μL lysis，其他操作同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bradford法的線性范圍

線性范圍是制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的依據(jù)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中報(bào)道的Bradford法的線性范圍是2～50 μg[19]或10～200 μg[18]，差異較大，因此需要加以明確。如圖1A所示，在0～1 000 μg范圍內(nèi)，A595隨著樣品中蛋白質(zhì)含量的增加而增加，但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量超過(guò)900 μg后A595趨于平穩(wěn)，說(shuō)明Bradford法最大檢測(cè)量為1 mg左右，線性關(guān)系較好的區(qū)段在0～200 μg以內(nèi)。通過(guò)在0～200 μg范圍內(nèi)增加數(shù)據(jù)點(diǎn)，并進(jìn)行0～100 μg、0～150 μg、0～200 μg范圍內(nèi)數(shù)據(jù)的線性擬合，獲得各范圍內(nèi)數(shù)據(jù)的線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9991、0.9767、0.9567，表明Bradford法的線性范圍是0～100 μg，超過(guò)100 μg后線性關(guān)系逐漸變差。根據(jù)線性范圍內(nèi)蛋白質(zhì)含量與對(duì)應(yīng)吸光度之間的關(guān)系，計(jì)算得出Bradford法的檢測(cè)限約為11 μg/mL。

2.2 Lysis及其成分對(duì)Bradford法的干擾

為探究lysis的背景干擾效應(yīng)，對(duì)10～100 μL范圍內(nèi)不同體積lysis與顯色液反應(yīng)的A595進(jìn)行了測(cè)定。如表1所示，lysis的干擾程度與其體積呈正相關(guān)(R2為0.986 2)。100 μL lysis與顯色液反應(yīng)產(chǎn)生的背景相當(dāng)于16.94 μg標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA與顯色液反應(yīng)產(chǎn)生的吸光度。10 μL lysis造成的背景干擾僅為100 μL lysis的1/3。

圖1 0～1 000 μg(A)及0～200 μg(B)范圍內(nèi)蛋白質(zhì)含量與A595的關(guān)系Fig.1 The relationship between protein content from 0 to 1 000 μg(A)and from 0 to 200 μg(B)and absorbance at 595 nm.

樣品成分Lysis (μL)H2O (μL)A595相當(dāng)于BSA值(μg)?110900.049±0.0055.39±0.55240600.095±0.00810.45±0.88370300.125±0.01313.75±1.43410000.154±0.02116.94±2.31

*各樣品均與5 mL顯色液反應(yīng)并測(cè)定595 nm處吸光度；根據(jù)0～100 μg范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各吸光度對(duì)應(yīng)的BSA值。

干擾Bradford法測(cè)定的化合物眾多，普遍認(rèn)為表面活性劑是造成干擾的主要因素[12,24,25]。表面活性劑的作用是在不破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、保持生物活性的情況下改善蛋白質(zhì)的溶解度。Lysis中的高濃度變性劑、表面活性劑、還原劑和兩性電解質(zhì)等都可與顯色液發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致背景干擾(圖2)。結(jié)果顯示，兩性電解質(zhì)Pharmalyte (pH 3～10)產(chǎn)生的背景干擾最大，其他組分產(chǎn)生的干擾較微弱，表明并不是所有表面活性劑都會(huì)嚴(yán)重干擾Bradford法。

Lysis中常用的表面活性劑有兩性離子型的CHAPS，以及非離子型的NP-40和Triton X-100等。圖3顯示不同表面活性劑之間差異極顯著。Triton X-100和NP-40引起的背景色極高，而CHAPS造成的背景干擾較小。100 μL 4% (w/V) Triton X-100和NP-40的A595(2.47)已經(jīng)超出1 mg蛋白質(zhì)的A595(Bradford法的最大檢測(cè)量，圖1)，導(dǎo)致無(wú)法測(cè)出準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)濃度。

圖2 Lysis不同組分對(duì)Bradford法的干擾程度Fig.2 The interfering effect of different components of lysis on the Bradford assay.注：加樣體積均為100 μL。

2.3 Lysis對(duì)蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

為研究lysis對(duì)蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物穩(wěn)定性的影響，本研究分別測(cè)定了有無(wú)lysis條件下1 h內(nèi)反應(yīng)液A595的變化。如圖4和表2所示，反應(yīng)體系中無(wú)lysis時(shí)，A595從混勻后3 min開始基本趨于穩(wěn)定，3～60 min內(nèi)變化幅度為+2.82%到-0.54%(以180 s時(shí)A595為基準(zhǔn))。本研究采用的顯色液組分與經(jīng)典Bradford法稍有不同，即磷酸含量從8.5%(w/V)提高到10.2%(w/V)。對(duì)比Bradford[12]的研究中0～70 min內(nèi)蛋白質(zhì)-染料穩(wěn)定性圖譜可以發(fā)現(xiàn)，磷酸比例的增加極大提高了蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的穩(wěn)定性。

圖3 三種表面活性劑對(duì)Bradford法的干擾程度Fig.3 The interfering effect of three kinds of detergents on the Bradford assay.注：加樣體積均為100 μL，各表面活性劑濃度均為4%(w/V)。

若反應(yīng)體系中存在lysis，則A595從混勻后2 min開始基本趨于穩(wěn)定，之后緩慢上升至12 min左右，然后一直呈下降趨勢(shì)，2～60 min內(nèi)變化幅度為+2.07%～-8.43%(以120 s時(shí)A595為基準(zhǔn))，約是無(wú)lysis時(shí)變化幅度的3倍，從50 min開始A595出現(xiàn)劇烈波動(dòng)。兩種條件下吸光度的變化表明lysis對(duì)蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的穩(wěn)定性有顯著影響。另外，比較圖4中兩條曲線可發(fā)現(xiàn)，對(duì)于相同蛋白質(zhì)含量樣品，當(dāng)反應(yīng)液中存在lysis時(shí)測(cè)得的吸光度值顯著高于無(wú)lysis時(shí)，說(shuō)明lysis會(huì)影響蛋白質(zhì)和染料之間的顯色反應(yīng)。

圖4 Lysis對(duì)蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物形成及穩(wěn)定性的影響Fig.4 The effect of lysis on the formation and stability of protein-dye complex.

表2 有無(wú)lysis兩種條件下BSA與顯色液反應(yīng)1 h內(nèi)A595的變化Table2 Absorbance change at 595 nm of the mixture made by BSA and dye reagent,with or without lysis buffer in 1 h.

2.4 加樣體積調(diào)整及其對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響

圖5顯示了加樣體積調(diào)整對(duì)0～50 μg范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響。當(dāng)加樣體積為100 μL時(shí)，測(cè)量數(shù)據(jù)波動(dòng)性較大，而且標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳(R2=0.996 8)，可能與lysis的背景干擾較大有關(guān)。當(dāng)加樣體積減少為10 μL時(shí)，測(cè)得數(shù)據(jù)穩(wěn)定性更好，線性關(guān)系也有明顯改善(R2=0.999 1)。

3 討論

本研究通過(guò)分析蛋白質(zhì)含量與吸光度的線性關(guān)系，確定Bradford法的線性范圍是0～100 μg，因此何忠效等[18]報(bào)道的線性范圍過(guò)大，而Okutucu[19]給出的線性范圍又偏小。當(dāng)加樣體積為100 μL時(shí)，與線性范圍對(duì)應(yīng)的濃度范圍是0～1 μg/μL；當(dāng)加樣體積為10 μL時(shí)，對(duì)應(yīng)的濃度范圍是0～10 μg/μL。在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，應(yīng)保證檢測(cè)范圍在線性范圍內(nèi)。另外，由于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的純度不同，稱量和配制過(guò)程也會(huì)有誤差，為使不同研究人員的定量數(shù)據(jù)具有可比性，應(yīng)對(duì)1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液進(jìn)行校準(zhǔn)。

圖5 不同加樣體積所得0～50 μg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Construction of the standard curve in the range of 0～50 μg(BSA)with different sample volume.

Bradford通過(guò)分析常用試劑對(duì)定量的影響，發(fā)現(xiàn)Bradford法對(duì)大多數(shù)常用化學(xué)物質(zhì)的兼容性較好，但高濃度的表面活性劑(1%的Triton X-100和SDS)會(huì)嚴(yán)重干擾測(cè)定[12]。本研究發(fā)現(xiàn)并非所有表面活性劑都會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，CHAPS產(chǎn)生的背景要遠(yuǎn)小于Triton X-100和NP-40。Lysis中表面活性劑的濃度高達(dá)4%(w/V)，若應(yīng)用Bradford法進(jìn)行定量，在配制lysis時(shí)應(yīng)避免使用Triton X-100和NP-40等，而選擇CHAPS或其他背景干擾較小的表面活性劑。

通過(guò)有無(wú)lysis條件下對(duì)蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物穩(wěn)定性的分析可知，lysis會(huì)影響蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的穩(wěn)定性。對(duì)于溶解在水中的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在1 h內(nèi)有很好的穩(wěn)定性，但對(duì)于溶解在lysis中的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物穩(wěn)定性降低，在反應(yīng)50 min以后尤其明顯。Bradford建議常規(guī)樣品在反應(yīng)后2～60 min內(nèi)測(cè)定吸光度[12]；但定量含lysis的2-DE樣品時(shí)，適宜的測(cè)定時(shí)間為反應(yīng)開始后3～30 min，該時(shí)間段內(nèi)A595的變化幅度約為1%，對(duì)測(cè)量值的影響較小。由于提高顯色液中磷酸含量可顯著改善蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的穩(wěn)定性，因此定量2-DE樣品時(shí)可將磷酸含量從8.5%(w/V)提高至10.2%(w/V)。

由于lysis會(huì)影響蛋白質(zhì)與染料的顯色反應(yīng)，導(dǎo)致相同含量蛋白質(zhì)在有無(wú)lysis條件下吸光度有較大差異，因此在測(cè)定2-DE樣品時(shí)不但要以相應(yīng)體積lysis做對(duì)照來(lái)消除lysis的背景干擾，還要在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)考慮到lysis的影響，在標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品和對(duì)照中都加入相應(yīng)體積的lysis，否則會(huì)使測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)較大偏差。至于lysis影響蛋白質(zhì)和染料相互作用的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

經(jīng)典Bradford法加樣體積為100 μL[12]。為使該法更適合定量2-DE樣品，將加樣體積調(diào)整為10 μL。減少加樣體積不但可以減少lysis導(dǎo)致的背景干擾，提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，還可以省去樣品稀釋步驟，簡(jiǎn)化操作。對(duì)于難提取的膜蛋白和其他特殊蛋白樣品，也可節(jié)省樣品。

綜上所述，本研究通過(guò)分析Bradford法的線性范圍、測(cè)定lysis及其組分的干擾效應(yīng)、分析lysis對(duì)蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物穩(wěn)定性的影響和調(diào)整加樣體積，針對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)2-DE樣品存在的主要問(wèn)題對(duì)Bradford法進(jìn)行了優(yōu)化，可為蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究人員快速掌握和應(yīng)用該法提供參考。