分泌酶抑制劑對乏氧環(huán)境下骨肉瘤細(xì)胞增殖及侵襲力影響的實驗研究

王淼 袁冰 劉平 李賀偉 劉洋 鄒利軍 郭朗

骨肉瘤好發(fā)于青少年，是最常見的惡性骨腫瘤[1]，其惡性程度高，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移是骨肉瘤患者死亡的最主要原因[2]。因此研究新型、高效、低毒的抗腫瘤藥物，對改善骨肉瘤患者的預(yù)后具有重要的意義，現(xiàn)已成為骨肉瘤治療研究的重點之一[3]。腫瘤組織具有缺血、缺氧的病理生理特點，目前普遍認(rèn)為腫瘤缺氧與其侵襲轉(zhuǎn)移特性密切相關(guān)[4]。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor, HIF）在腫瘤缺氧應(yīng)答體系中居于核心調(diào)控位置[5]，而針對細(xì)胞缺氧反應(yīng)最重要的介質(zhì)是缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1。Zanotti S 等[6]研究證實骨肉瘤細(xì)胞的增殖及分化主要由Notch1 信號通路激活所致，并且其調(diào)控骨肉瘤干細(xì)胞更新、分化、存活及增殖。Notch1 通路的激活可調(diào)控下游靶基因，對骨腫瘤細(xì)胞增殖及分化具有重要作用[7]。HIF-1 與Notch1 通路在乏氧微環(huán)境中關(guān)系較密切，乏氧環(huán)境下HIF-1 表達上調(diào)并促進Notch1 的表達，同時誘導(dǎo)增殖、侵襲及引起分化阻滯等[8-9]。Hes-1 是胚胎發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄抑制因子，它可以調(diào)節(jié)祖細(xì)胞的功能，而Notch1轉(zhuǎn)錄因子是促進Hes-1 基因表達的主要激活劑，在缺氧環(huán)境下已經(jīng)證明了Notch1的表達上調(diào)能誘導(dǎo)Hes-1的表達，Notch-1通路在多種細(xì)胞中主要通過Hes-1 發(fā)揮作用[10]。本研究通過體外試驗探討在乏氧微環(huán)境下阻斷Notch1 通路對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，旨在為臨床治療骨肉瘤提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞

骨肉瘤細(xì)胞系MG-63 購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。采用體外分離培養(yǎng)獲取后細(xì)胞培養(yǎng)至第3 代時選取狀態(tài)較好的細(xì)胞進行實驗。

1.2 主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)主要試劑：二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma 公司，美國）；MEM（Hyclone 公司，美國）；100 U/mL 青霉素、100 pg/mL 鏈霉素（Hyclone 公司，美國）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Sciencell公司；胰蛋白酶（Trypsin）購自原培生物制品有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）（Hyclone 公司，美國）；Transwell 小室（Corning 公司，美國）；臺盼藍（Sigma 公司，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

骨肉瘤細(xì)胞株MG-63 均培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱的環(huán)境中。培養(yǎng)細(xì)胞所用完全培養(yǎng)基為MEM（含有10%的胎牛血清，100 U/mL 的青霉素、鏈霉素）。細(xì)胞每3 天換一次液，取對數(shù)期細(xì)胞用于實驗，將其分為3 種不同藥物濃度梯度的處理組。每組在不同實驗條件下分別按不同時間點24 h、48 h、72 h 進行檢測。最終確定的乏氧模型組以37℃、CO2濃度為5%、O2濃度為1%的培養(yǎng)箱處理48 h 為主，并提取蛋白質(zhì)。

1.3.2 實驗分組

將骨肉瘤細(xì)胞株MG-63 細(xì)胞置于乏氧（37℃，1%O2，5%CO2）環(huán)境下培養(yǎng)作為乏氧組，以正常氧環(huán)境（37℃，21%O2，5%CO2）下培養(yǎng)作為正常組，培養(yǎng)24h、48h、72h，組別分為乏氧組、正常組和含有DAPT 的乏氧組（實驗組），其中DAPT 的濃度分別為1 M、5 M、10 M。

1.3.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測

采用CCK-8 方法檢測細(xì)胞的增殖能力，評估細(xì)胞生長抑制情況，每組實驗重復(fù)3 次，以550 nm 和750 nm 分別作為檢測波長和參照波長測定各孔光密度值（OD 值），每組細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1－加藥孔平均OD 值/對照孔平均OD 值）×100%。IC50 值，即細(xì)胞增殖受抑制后所剩數(shù)目與全部細(xì)胞數(shù)之比等于50%時所對應(yīng)的濃度。采用SPSS 11.5 軟件進行計算，并且將該IC50 值作為后續(xù)實驗濃度。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)移實驗

按照9∶1 的體積比用無血清培養(yǎng)基稀釋ECM 膠后，以每孔50 L 的體積加到Transwell 小室的上室，并放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h。待孵育完畢后，小心吸棄上室因為ECM 膠凝固而析出的液體之后，每孔再加入200 L 無血清培養(yǎng)基于37℃環(huán)境下水化30 min。小心移棄上室水化培養(yǎng)基，離心收集消化下來的已處理的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105/mL，于上室中加入200 L 含有細(xì)胞的懸液，下室中加入預(yù)先配好的包含30%FBS 濃度的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 以后，取出小室，用多聚甲醛固定細(xì)胞后洗凈再用結(jié)晶紫進行染色，在用棉簽仔細(xì)擦去上室細(xì)胞后，于顯微鏡下分9 個視野逐一觀察小室下室穿過的細(xì)胞數(shù)目并拍照用于進一步的分析。

1.3.5 細(xì)胞周期及凋亡

細(xì)胞處理完成后，用于檢測周期的細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化收集以后離心，PBS 反復(fù)清洗2 次以后用預(yù)冷的濃度為70%的乙醇固定并于冰箱內(nèi)過夜。用于檢測凋亡的細(xì)胞消化后和培養(yǎng)基上清混合再常規(guī)離心進行收集。固定好的細(xì)胞進行離心后吸棄上清并再用PBS 清洗2 次以后，用160 L PBS 重懸細(xì)胞并加入20 L 濃度為50 g/mL 的PI 以及20 L濃度為25 g/mL 的RNase-A 避光條件下37℃孵育15 min。用于檢測凋亡的細(xì)胞則用500 L 緩沖液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，然后加入5 L AnnexinV-FITC 以及10 L PI（20 g/mL）4℃條件下孵育15 min。最后把處理好的細(xì)胞混勻后移到流式管內(nèi)，用流式細(xì)胞儀進行檢測。檢測結(jié)束后用Flowjo 軟件分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)，所有試驗獨立重復(fù)3 次。

1.3.6 細(xì)胞樣本蛋白提取

首先，用無菌PBS 反復(fù)漂洗細(xì)胞3 遍，向樣本中加入適量的含有1%濃度PMSF 的RIPA 強裂解液，將細(xì)胞樣本充分吹打洗刮后置于冰上15 min。收集混合液于1.5 mL EP管后用超聲細(xì)胞破碎儀破碎2 次，每次2 s。再將EP 管置于已經(jīng)預(yù)冷至4℃的低溫高速離心機中進行離心（12 000 rpm，10 min）。離心完成后小心轉(zhuǎn)移上清至另一個1.5 mL EP 管中，隨后用蛋白定量試劑盒對所提取蛋白質(zhì)的蛋白濃度進行檢測。最后，向所得蛋白中加入1/4 蛋白體積的上樣緩沖液并煮沸10 min 使蛋白質(zhì)完全變性。

1.3.7 蛋白印跡實驗測相關(guān)蛋白的表達

轉(zhuǎn)膜完畢后，打開轉(zhuǎn)膜夾放入用TBST 配制的5%脫脂牛奶內(nèi)進行封閉，并放置于搖床1 h。取出PVDF 膜，用TBST 洗滌1 遍，并按照抗體說明書上的建議稀釋比例用一抗稀釋液配制一抗，將配好的抗體滴加一抗孵育盒內(nèi)以覆蓋住有目的蛋白面為宜，將一抗孵育盒置于冰箱內(nèi)4℃孵育過夜。孵育完畢后，取出一抗中的PVDF 膜，放入TBST 內(nèi)并置于搖床上，漂洗15 min 重復(fù)3 次，并回收一抗。按照二抗說明書上的建議比例用用TBST 配制的5%脫脂牛奶配制二抗，并將二抗孵育盒置于搖床上混勻，待PVDF 膜洗滌完畢，將條帶放置在二抗中孵育1 h。1 h 后取出PVDF 膜，再放入TEST 內(nèi)搖床上漂洗15 min，重復(fù)3 次。最后按照1：1 的比例制備ECL AB 發(fā)光液，對PVDF 膜進行曝光，檢測目的條帶。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.5 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用One-way ANOVA 分析和t 檢驗；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乏氧環(huán)境下及DAPT 介導(dǎo)Notch 下調(diào)抑制骨肉瘤細(xì)胞促增殖及周期的影響

CCK-8 法檢測結(jié)果顯示如圖（見圖1），表明乏氧狀態(tài)下能促進骨腫瘤細(xì)胞MG-63 增殖，12 h 后隨著時間延長，乏氧的促進增殖作用明顯增加，在48 h 常氧及乏氧對細(xì)胞增殖的作用可見明顯差異；MG-63 細(xì)胞經(jīng)過DAPT 下調(diào)Notch1 表達后置入乏氧環(huán)境下孵育72 h，細(xì)胞增殖作用明顯下降，在作用48 h 后MG-63 細(xì)胞增殖顯著減慢，證明DAPT 確能通過Notch1 通路來抑制MG-63 細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞儀檢測MG-63 細(xì)胞在乏氧狀態(tài)下72 h 的細(xì)胞周期分布情況（見圖2），與正常組相比，乏氧組G0/G1 期細(xì)胞較正常組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；MG-63 細(xì)胞經(jīng)過DAPT 下調(diào)Notch1 表達后置入乏氧環(huán)境下孵育72 h，細(xì)胞周期分布發(fā)生變化，與正常組相比，乏氧能明顯促進細(xì)胞向G2 期轉(zhuǎn)化，促進細(xì)胞增殖，而實驗組呈G0 期阻滯。

圖1 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖（圖中NC為正常組、Hypoxia為乏氧組、Hypoxia+DAPT 為實驗組）

圖2 流式細(xì)胞儀檢測MG-63 細(xì)胞在乏氧狀態(tài)下72 h 的細(xì)胞周期分布情況（圖中NC 為正常組、Hypoxia 為乏氧組、Hypoxia+DAPT 為實驗組）

2.2 乏氧環(huán)境下及DAPT 介導(dǎo)Notch 下調(diào)乏氧環(huán)境下對MG-63 細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

參照Transwell 小室說明書，同步化處理正常組與乏氧組的細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察并進行穿膜細(xì)胞計數(shù)。Transwell實驗結(jié)果如圖3 顯示，乏氧組比正常組在單位視野下，48 h內(nèi)細(xì)胞穿膜數(shù)量增多。實驗組比乏氧組在單位視野下，48 h內(nèi)細(xì)胞穿膜數(shù)量減少。

圖3 Transwell 實驗顯示48 h 內(nèi)細(xì)胞穿膜數(shù)量來驗證其轉(zhuǎn)移能力（×400 倍，圖中NC 為正常組、Hypoxia 為乏氧組、Hypoxia+DAPT 為實驗組）

2.3 乏氧環(huán)境能調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的相關(guān)蛋白的改變

Western Blot 檢測乏氧環(huán)境下HIF-1 的表達明顯上調(diào)。乏氧狀態(tài)下乏氧組與正常組MG-63 細(xì)胞相比，HIF-1 下游的Notch1、Hes-1 蛋白表達情況如圖4 所示，蛋白表達增強且呈時間依耐性（見圖4）。

圖4 乏氧狀態(tài)下乏氧組與正常組MG-63 細(xì)胞相比，HIF-1 下游的Notch1、Hes-1 蛋白表達情況（圖中NC為正常組、Hypoxia 為乏氧組）

2.4 乏氧環(huán)境下DAPT阻斷Notch1 通路對骨肉瘤細(xì)胞的Notch蛋白表達影響

Western Blot 檢測不同條件下MG-63 細(xì)胞骨腫瘤Notch1-ICN 蛋白表達變化，正常組、乏氧組和實驗組蛋白表達分別為圖5 所示。在乏氧環(huán)境下，DAPT 阻斷Notch1 通路的MG-63細(xì)胞Notch1、Hes-1 蛋白明顯下調(diào)，且與DAPT 的濃度呈依耐性，乏氧組與實驗組Notch1-ICN 蛋白表達具有明顯差異（P＜0.05）。

圖5 乏氧環(huán)境下，DAPT 阻斷Notch1 通路的MG-63 細(xì)胞Notch1、Hes-1 蛋白明顯下調(diào)，且與抑制劑DAPT 的濃度呈依耐性（圖中NC為正常組、Hypoxia 為乏氧組、Hypoxia+DAPT 為實驗組）

3 討論

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的骨原發(fā)性惡性腫瘤，其惡性程度高、生長快且易轉(zhuǎn)移，臨床預(yù)后差，好發(fā)于兒童及青少年，常規(guī)方法治療效果仍不理想。隨著近年來新輔助化療和手術(shù)治療的應(yīng)用，使得惡性骨肉瘤的保肢率及生存率有了較大提升，但較高的死亡率使得骨肉瘤的臨床治療仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。惡性腫瘤的過度生長和異常增殖超過新生血管形成的速度而造成的氧擴散距離增加會引起慢性缺氧，使得實體瘤內(nèi)出現(xiàn)乏氧微環(huán)境，缺氧將觸發(fā)基因的表達變化，它能通過幾種機制來促進腫瘤的進展，包括新生血管的形成和增加細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、耐藥能力等。已經(jīng)證實骨肉瘤存在乏氧微環(huán)境，乏氧可促進骨肉瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力增強等[11]。在乏氧微環(huán)境下，HIF-1 在維持腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲及腫瘤耐藥等方面發(fā)揮重要的作用。

研究[12]顯示腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Notch 的活化關(guān)系密切，其參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及耐藥等。Notch 的異常表達已經(jīng)在人類許多實體瘤中發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、肺癌等惡性腫瘤疾病中存在異常表達[13]。Notch 信號通路包括Notch 配體、受體，陰性和陽性調(diào)節(jié)劑以及Notch 靶向轉(zhuǎn)錄因子。對于Notch1 與骨肉瘤的研究，國內(nèi)學(xué)者李永剛等[14]指出大蒜素和姜黃素能夠通過下調(diào)Notch1 信號通路和上調(diào)腫瘤抑制基因miRNAs 來誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞周期阻滯、凋亡增加來抑制骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展，從而發(fā)揮抗骨肉瘤作用。國內(nèi)外研究提示多種分子可通過激活Notch 信號來增強骨肉瘤侵襲力及其增殖能力，研究Notch1 信號通路的抑制劑將成為腫瘤治療的新思路。實驗研究表明，乏氧微環(huán)境下轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HIF-1 被激活使其下游Notch1 表達上調(diào)引起Notch1 信號通路的激活，同時誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖及腫瘤侵襲力增強等[15]。這些發(fā)現(xiàn)提示骨肉瘤Notch1 通路的抑制劑（分泌酶抑制劑）將成為Notch 靶向治療的的有效靶點。

本研究中選用的骨肉瘤MG-63 細(xì)胞系存在較高的Notch1 信號表達。研究結(jié)果中圖1 顯示骨肉瘤細(xì)胞在乏氧微環(huán)境下可以明顯增殖，在圖2 中顯示乏氧微環(huán)境下G1/G2 期細(xì)胞減少，證明乏氧微環(huán)境能促使骨肉瘤細(xì)胞MG-63 周期從G0/G1 向G2/M 轉(zhuǎn)化，而實驗組呈G0 期阻滯增多說明DAPT 對骨肉瘤細(xì)胞MG-63 增殖的抑制作用明顯。圖3 也印證了DAPT 抑制骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。細(xì)胞增殖與乏氧微環(huán)境下HIF-1 激活有關(guān)，圖4 中已經(jīng)證實在乏氧狀態(tài)下HIF-1 與Notch基因水平及蛋白水平均表達上調(diào)并且呈時間依耐性。圖5 應(yīng)用 分泌酶抑制DAPT 下調(diào)Notch1 能誘導(dǎo)乏氧環(huán)境下骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力減弱，且強調(diào)了Notch1 是乏氧的下游通路，阻斷Notch1 可以逆轉(zhuǎn)乏氧對骨肉瘤細(xì)胞MG-63 細(xì)胞的促增殖作用，提示Notch1 是骨肉瘤細(xì)胞惡性增殖的有效分子靶點。圖5 顯示DAPT 作為Notch1 通路的有效抑制劑其抑制作用呈濃度依耐性，本研究選取10 M 濃度的DAPT 作為本研究的實驗濃度，在10 M 的作用濃度下，基因水平及細(xì)胞周期都能發(fā)生阻滯，可見腫瘤細(xì)胞的侵襲力在DAPT 的作用下得到有效抑制（見圖1、圖2、圖3）。上述結(jié)果均顯示在乏氧微環(huán)境下HIF-1 在骨肉瘤中的表達模式和生物學(xué)功能，同時初步闡明了其通過調(diào)控下游靶基因Notch1 從而影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的作用機制，這為深入了解骨肉瘤發(fā)生發(fā)展機制提供了理論指導(dǎo)，同時為骨肉瘤的診斷和治療提供了新的思路。

乏氧微環(huán)境下HIF-1 活化是細(xì)胞乏氧應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，HIF-1 的轉(zhuǎn)錄激活能增強腫瘤細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運及糖酵解能力，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖及代謝的生理學(xué)過程[16]。乏氧環(huán)境下HIF-1 與Notch 相互作用，誘導(dǎo)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程。

綜上所述，本研究選取HIF-1 及Notch1 信號通路作為作用靶點進行細(xì)胞體外實驗，研究結(jié)果顯示DAPT 可通過下調(diào)Notch1 通路顯著抑制乏氧狀態(tài)下骨肉瘤細(xì)胞株MG-63的增殖與侵襲。DAPT 作為骨肉瘤的靶向治療藥物，與傳統(tǒng)藥物相比具有更加光明的應(yīng)用前景；接下來將進一步研究明確在體動物實驗中DAPT 對骨肉瘤MG-63 細(xì)胞系生物學(xué)影響的具體作用機制，為將來DAPT 臨床應(yīng)用治療骨肉瘤提供新的思路和依據(jù)。