膠原水凝膠在軟骨與骨組織工程中的研究進(jìn)展

劉永龍 黃江鴻 熊建義 王大平,

膠原水凝膠是一類具有親水基團(tuán)，不溶解于水卻遇水溶脹并且保持其穩(wěn)定的三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的聚合物材料[1]。膠原水凝膠通過共價鍵、范德華力或氫鍵等相互作用而交聯(lián)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，吸收水后能夠顯著溶脹，保留大量的水分并且能夠保持其原有的三維結(jié)構(gòu)而不被溶解，同時在一定條件下又可以脫水退溶脹。因為其含水量高，溶脹快，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定與組織具有良好的相容性，膠原水凝膠作為仿生支架在軟骨與骨組織工程學(xué)方面具有廣闊的研究和發(fā)展前景[2]。近幾十年來，隨著國內(nèi)外科研工作者對膠原水凝膠的結(jié)構(gòu)、性能和應(yīng)用的研究的逐漸深入，膠原水凝膠在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用前景逐漸引起巨大的關(guān)注。

1 膠原水凝膠的性能

膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在維持細(xì)胞外基質(zhì)生物學(xué)性能和結(jié)構(gòu)完整性方面起重要的作用。膠原本身具有特殊的四級結(jié)構(gòu)，在特定情況下可以自發(fā)聚集形成膠原纖維[3]，并進(jìn)一步形成水凝膠。膠原的這種自組裝行為不但受到所處環(huán)境中的理化因素影響，而且通過引入外源性的添加物，也可以使水凝膠的最終結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物化性能發(fā)生顯著改變。

但是因單純的膠原水凝膠機(jī)械強(qiáng)度不足、耐熱性欠佳，有研究表明通過適當(dāng)降低復(fù)合水凝膠中的膠原含量或者對膠原進(jìn)行改性后制備獲得的復(fù)合膠原水凝膠更有利于細(xì)胞生長并具備更加良好的生物力學(xué)性能。已有進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，將膠原蛋白與其他高分子材料交聯(lián)后可以顯著提高水凝膠的拉伸強(qiáng)度及抗降解能力[4]，達(dá)到軟骨組織工程應(yīng)用的要求。隨著研究的深入，外源性引入物的報道層出不窮，除了經(jīng)典的殼聚糖和聚乙烯醇外，海藻酸鹽、羥基磷灰石、聚乙二醇和透明質(zhì)酸等材料作為外源性添加物也取得良好的效果。這些外源性添加物雖然不具有膠原的自組裝性能，但是通過與膠原的相互交聯(lián)而形成的膠原水凝膠，具備了單純膠原水凝膠所不具備的更加優(yōu)越的生物力學(xué)性能、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

2 復(fù)合膠原水凝膠的種類

2.1 膠原-聚乙烯醇復(fù)合水凝膠

單純的聚乙烯醇水凝膠因聚乙烯醇本身的親水性和生物惰性，不利于其植入體內(nèi)的血管的生成。聚乙烯醇進(jìn)行與膠原等材料交聯(lián)制備的復(fù)合水凝膠的結(jié)構(gòu)和性能更加接近關(guān)節(jié)軟骨。有文獻(xiàn)報道[4]將聚乙烯醇與明膠溶液反復(fù)冷凍-融化獲得一種大孔徑的不可降解的復(fù)合水凝膠生物支架，這種復(fù)合水凝膠在兔軟骨缺損模型中保持了良好的固定狀態(tài)，并不會引起炎癥反應(yīng)，也不會對周圍的軟骨產(chǎn)生損害。倪茂君等[5]研究者用輻射交聯(lián)與凍融循環(huán)相結(jié)合的方法，制備出配比最佳的聚乙烯醇/聚乙烯基吡咯烷酮/膠原復(fù)合水凝膠，研究發(fā)現(xiàn)膠原的含量與復(fù)合水凝膠的含水量成正相關(guān)，與復(fù)合水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度成負(fù)相關(guān)。

2.2 殼聚糖膠原復(fù)合水凝膠

殼聚糖是多糖中僅有的一種堿性氨基多糖，其來源廣泛，某些理化性質(zhì)與細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分氨基多糖極其相似，具有良好的天然抗菌性、生物降解性和組織相容性[6]。殼聚糖通過化學(xué)修飾改性后可以獲得特殊理化性質(zhì)，使用改性后的殼聚糖制備的復(fù)合水凝膠具有更好的生物相容性和生物力學(xué)性能。Liu 等[7]研究者用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對殼聚糖進(jìn)行改性后，改性后的殼聚糖的氨基與被氧化的金剛乙醛的醛基交聯(lián)反應(yīng)。結(jié)果表明這種水凝膠具有清晰穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，具有較好的生物相容性和凝血功能。在軟骨組織工程方面，以殼聚糖為組分的復(fù)合水凝膠也引起了關(guān)注。針對軟組織工程需求的較高機(jī)械強(qiáng)度的水凝膠，有文獻(xiàn)報道[8]發(fā)現(xiàn)殼聚糖可以有效提高復(fù)合水凝膠的生物力學(xué)性能，氧化鋯、殼聚糖和明膠交聯(lián)而成的高密度復(fù)合水凝膠在恒河猴腰椎缺陷模型實驗中表現(xiàn)中較高的抗壓能力，并有類似自體骨的修復(fù)效果。Ghorbani 等[9]使用改性后的殼聚糖與明膠、Ⅱ型膠原蛋白和蠶絲蛋白交聯(lián)制備的復(fù)合水凝膠表現(xiàn)出優(yōu)良的可注射型，這種復(fù)合水凝膠在4℃時表現(xiàn)為透明溶液，在37℃環(huán)境下30 min后為凝膠態(tài)，并具有良好的組織相容性和細(xì)胞吸附性。

2.3 透明質(zhì)酸膠原復(fù)合水凝膠

透明質(zhì)酸是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的一種成分，在眾多的生物材料中具有優(yōu)良的生物相容性，更高的結(jié)構(gòu)孔隙率，更大的比表面積，并且具有促進(jìn)細(xì)胞與生物之間結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞分化、分裂等生物行為的作用，是一種理想的軟骨組織工程材料。但是單純的透明質(zhì)酸-膠原復(fù)合水凝膠存在生物力學(xué)性能較差、機(jī)械強(qiáng)度不夠，并且透明質(zhì)酸作為一種生物多糖容易從支架材料中溶出，使其應(yīng)用受到限制。Moulisova 等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，同一種配比制備的透明質(zhì)酸膠原復(fù)合水凝膠，采用化學(xué)和光化學(xué)交聯(lián)方法制備的復(fù)合水凝膠與生物酶交聯(lián)方法制得的復(fù)合水凝膠在生物體內(nèi)更容易引發(fā)炎癥反應(yīng)。有研究者進(jìn)一步研究[11]發(fā)現(xiàn)，在透明質(zhì)酸膠原復(fù)合水凝膠中適量引入葡萄糖胺可以降低膠原的含量，進(jìn)而降低復(fù)合水凝膠的交聯(lián)密度，其生物力學(xué)性能更加適用于軟骨組織缺損的修復(fù)。值得一提的是，透明質(zhì)酸作為軟骨細(xì)胞基質(zhì)的一部分，透明質(zhì)酸細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合水凝膠與透明質(zhì)酸膠原復(fù)合水凝膠相比，更能促進(jìn)人脂肪源干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

2.4 海藻酸鈉膠原復(fù)合水凝膠

海藻酸鈉是一種來自褐藻的天然多糖，最早由英國化學(xué)家Stanford 首先對其研究，發(fā)現(xiàn)它具有濃縮溶液、形成凝膠和成膜的能力，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的生物力學(xué)性能、生物相容性和低免疫原性，但是因海藻酸鈉過強(qiáng)的親水性使細(xì)胞很難與其產(chǎn)生足夠的黏附性進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為[12]。膠原對細(xì)胞具有良好吸附性而機(jī)械性能較差，與海藻酸鈉交聯(lián)后可以得到優(yōu)劣互補(bǔ)的復(fù)合膠原水凝膠。有文獻(xiàn)報道對海藻酸鈉用氧化劑進(jìn)行氧化修飾后得到醛酸鈉，醛酸鈉進(jìn)一步與甲基丙烯酸甲酯反應(yīng)后得到的產(chǎn)物與改性后的明膠水溶液混合發(fā)生Schiff 反應(yīng)，然后在365 nm 紫外線照射下交聯(lián)形成復(fù)合水凝膠。此種復(fù)合水凝膠的特點(diǎn)是具有雙交聯(lián)二級網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，與單一交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠相比，具有更好的力學(xué)性能、生物相容性和可控生物降解率。宋益哲等[13]研究者將膠原溶液與海藻酸鈉溶液進(jìn)行共混處理制備得到膠原-海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠，該水凝膠孔隙分布均勻，多為貫穿孔，疏水性得到顯著增強(qiáng)使得細(xì)胞黏附性增強(qiáng)，更有利于細(xì)胞的遷移。

2.5 其他材料與膠原交聯(lián)制備的復(fù)合水凝膠

除了聚乙烯醇、殼聚糖、透明質(zhì)酸和海藻酸鈉被廣泛用于膠原復(fù)合水凝膠，聚乙二醇[14]、纖維素[15]等與膠原交聯(lián)制備的復(fù)合水凝膠在創(chuàng)傷血管、神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域均有涉獵。復(fù)合膠原水凝膠往往是用于損傷部位，有研究者在復(fù)合水凝膠中加入適當(dāng)?shù)母杉?xì)胞[16]或者細(xì)胞生長因子[17]取得良好的促進(jìn)組織修復(fù)的結(jié)果。以Fe3O4為代表的的磁性納米復(fù)合水凝膠結(jié)合了納米材料更加優(yōu)良的容水性能和組織相容性與磁性材料的磁場響應(yīng)性[18]，磁性納米顆粒在一定時間里可被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞吞噬，從而避免了在體內(nèi)組織殘留的問題，這種水凝膠可應(yīng)用于藥物的運(yùn)輸、釋放[19]，骨與軟骨組織工程填充材料[20]等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

3 膠原水凝膠的制備及其應(yīng)用

3.1 膠原水凝膠的交聯(lián)方法

膠原水凝膠本質(zhì)是一種高分子聚合物，根據(jù)其鍵合方式的不同，交聯(lián)方法可分為物理交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)兩種方法。

3.1.1 物理交聯(lián)

物理交聯(lián)是在紫外光照射[21]、射線輻照[22]、加熱、冷凍干燥[5,8]等物理處理條件下，氫鍵、離子鍵、結(jié)晶區(qū)域或疏水作用等非共價鍵作用使高分子產(chǎn)生相互交聯(lián)的一種方式。通過物理交聯(lián)制備的膠原水凝膠形態(tài)不具備永久性，常溫下為凝膠態(tài)，通過加熱可以轉(zhuǎn)化為溶液，故又稱之為“假凝膠”。物理交聯(lián)方法的優(yōu)點(diǎn)是交聯(lián)過程中凝膠的各組分不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，避免了可能有毒性作用的新物質(zhì)產(chǎn)生，但是其不足也很明顯，生物力學(xué)強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性不足，制備出的膠原水凝膠的結(jié)構(gòu)均勻程度也有欠缺[6]。目前報道的適用物理交聯(lián)方法的主要有殼聚糖、葡萄糖、聚乙烯醇、海藻酸等。

3.1.2 化學(xué)交聯(lián)

化學(xué)交聯(lián)是通過選用合適的交聯(lián)試劑對膠原中的羧基、氨基等官能團(tuán)進(jìn)行修飾與反應(yīng)，高分子鏈相互交聯(lián)后形成需要的膠原水凝膠。在化學(xué)交聯(lián)中交聯(lián)劑的選擇起到關(guān)鍵性的作用，交聯(lián)劑多為帶醛基的化學(xué)試劑，如：戊二醛、聚乙烯醇等?；瘜W(xué)交聯(lián)方法的優(yōu)點(diǎn)是制備出的膠原水凝膠的生物力學(xué)性能和熱穩(wěn)定性較好，缺點(diǎn)是生物降解性和生物相容性較差[19]，尤其是小分子的二醛可能具有細(xì)胞毒性。目前報道的化學(xué)交聯(lián)方法使用的交聯(lián)劑包括：乙二醛、聚丙烯酸、聚乙二醇等。

3.2 膠原水凝膠在軟骨與骨組織工程中的應(yīng)用

3.2.1 膠原水凝膠在軟骨組織工程中的應(yīng)用

軟骨組織缺損一直是骨科基礎(chǔ)與臨床研究領(lǐng)域面臨的一大難題。在軟骨組織工程的研究中，關(guān)于各類型的膠原基復(fù)合水凝膠的報道層出不窮。隨著研究的深入，膠原水凝膠在軟骨組織工程方面的應(yīng)用不再只滿足于單純的填充修復(fù)，科研人員發(fā)現(xiàn)可以將軟骨組織工程三要素：種子細(xì)胞、支架材料及細(xì)胞因子[23]中的種子細(xì)胞和細(xì)胞因子加入到復(fù)合膠原水凝膠這種仿生材料中，使這種仿生材料在填充軟骨缺損的同時具有誘導(dǎo)軟骨生成的作用[1,15]，從而得到一個三位一體的解決方案。Fensky 等[24]將人間充質(zhì)干細(xì)胞加入到復(fù)合膠原水凝膠中，體外實驗表明10 d 后復(fù)合膠原水凝膠中的人間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出向軟骨分化的傾向。可注射型膠原水凝膠有廣泛的應(yīng)用前景，受到生物材料學(xué)家的特別關(guān)注，因為它們可以以最小代價完成微創(chuàng)手術(shù)進(jìn)行注射，如圖1 所示膠原水凝膠在軟骨組織工程應(yīng)用過程，可注射性膠原水凝膠可以任意形成以匹配不規(guī)則的缺陷形狀達(dá)到修復(fù)軟骨組織損傷的目標(biāo)[25]。

3.2.2 膠原水凝膠在骨組織工程中的應(yīng)用

臨床中骨缺損發(fā)生的病理機(jī)制具有高度復(fù)雜性，尤其是大面積的骨組織缺損，骨組織填充材料的研究對骨組織工程的發(fā)展起著非常重要的作用[26]。有學(xué)者[27]認(rèn)為骨缺損填充材料本身的力學(xué)結(jié)構(gòu)性能和其與骨組織的連接緊密程度是骨缺損修復(fù)成功與否的關(guān)鍵。種類眾多的骨缺損填充材料中骨水泥、鈦合金、鉭合金、磷酸三鈣[28]等填充材料的研究較為廣泛。有研究[29]發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度的膠原水凝膠因為更好的組織相容性和多孔隙結(jié)構(gòu)是一種良好的骨缺損填充材料。Xavier 等[30]制備的納米復(fù)合膠原水凝膠中含有納米級別的硅酸鹽顆粒，強(qiáng)度顯著提升并且與周圍骨組織的緊密程度增加，在沒有加入任何誘導(dǎo)因子的情況下仍然能夠促進(jìn)骨組織的生成。Yuan 等[31]研究者使用納米殼聚糖制備的復(fù)合膠原水凝膠也取得類似的結(jié)果。

圖1 可注射型膠原水凝膠修復(fù)軟骨組織損傷

4 討論

經(jīng)過科研人員的不斷探索，膠原水凝膠應(yīng)用于軟骨與骨組織工程的研究不斷深入，然而軟骨與骨組織工程對生物材料在生物學(xué)力學(xué)性能、組織相容性和降解性等有很高要求，膠原水凝膠在軟骨與骨組織工程領(lǐng)域的研究仍有進(jìn)一步探索的空間。

以具有優(yōu)良組織相容性的膠原為基礎(chǔ)，進(jìn)而探尋其他合適的一種或者多種與膠原形成優(yōu)勢互補(bǔ)的生物材料按照一定工藝流程與膠原共同制備出適用于軟骨與骨組織工程的生物支架材料，這既是膠原水凝膠設(shè)計的核心思路，也是設(shè)計的難點(diǎn)[32]。軟骨與骨組織工程對生物支架材料的生物力學(xué)性能有很高的要求，在設(shè)計膠原水凝膠時必須保證其具有一定的生物力學(xué)性能。提高膠原水凝膠的生物力學(xué)性能有兩種途徑：原材料的篩選和制備工藝的優(yōu)化。膠原本身的機(jī)械強(qiáng)度不足，但是可以引入具有優(yōu)良生物力學(xué)的生物材料組分。不論是傳統(tǒng)的生物材料如殼聚糖、聚乙烯醇等，還是近期蓬勃發(fā)展的新型生物材料如納米材料、磁性材料等，通過調(diào)節(jié)組分原材料的比例以獲得滿意的生物力學(xué)性能是一種較有效的解決思路。另一方面，制備的工藝也對膠原水凝膠內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起到?jīng)Q定性的作用。與物理交聯(lián)相比，化學(xué)交聯(lián)制備出的膠原水凝膠的生物力學(xué)穩(wěn)定性一般更優(yōu)[19]，但是制備工藝中影響膠原水凝膠生物力學(xué)性能的因素很多，作者在研究中發(fā)現(xiàn)即使是相同的組分、同一種交聯(lián)方法，制備過程中的處理溫度、時長等因素都會影響到膠原水凝膠最終的生物力學(xué)性能。膠原水凝膠的制備流程還需考慮原材料的特性，適當(dāng)情況下，多種交聯(lián)方式結(jié)合也是一種很好的選擇。

膠原水凝膠做為一種植入性生物材料，應(yīng)具有優(yōu)良的組織相容性，同時具有可控的降解性。設(shè)計膠原水凝膠時選取的組分原材料本身應(yīng)具有一定組織相容性，對于組織相容性較差的組分，可以適當(dāng)降低其比例以達(dá)到預(yù)期的組織相容性。應(yīng)特別注意制備過程中其他引入物對膠原水凝膠的組織相容性的影響，有影響的引入物包括交聯(lián)劑、發(fā)泡劑和采用化學(xué)交聯(lián)制備過程中生成的其他產(chǎn)物[4]。應(yīng)用于軟骨與骨組織工程的膠原水凝膠在體內(nèi)的降解應(yīng)與軟骨與骨組織的再生修復(fù)同步銜接進(jìn)行。膠原水凝膠的生物力學(xué)穩(wěn)定性與可降解性有一定的沖突關(guān)系，而在降解過程中維持一定的生物力學(xué)穩(wěn)定性也是一個研究的難點(diǎn)，調(diào)節(jié)二者之間的關(guān)系需要大量的重復(fù)實驗進(jìn)行探索。膠原水凝膠體外的降解實驗具有簡單易行、低成本的優(yōu)點(diǎn)，可以初步評估膠原水凝膠的降解性能，準(zhǔn)確的降解性能數(shù)據(jù)則需要進(jìn)行動物實驗進(jìn)行采集，在時間、精力和經(jīng)濟(jì)方面的成本較高。

目前國內(nèi)外尚無商品化的膠原水凝膠產(chǎn)品應(yīng)用于軟骨與骨組織工程，相關(guān)的研究大多停留在制備工藝和動物實驗的探索階段。對于膠原水凝膠的性能評估與測定，主要包括微觀表征、含水率、溶脹性、拉伸與壓縮性能、組織相容性、降解性和細(xì)胞增殖、分化的指標(biāo)測定[33]，雖然最重要的指標(biāo)還是其在軟骨與骨損傷表面的修復(fù)效果[11]，但是某一項指標(biāo)的短板出現(xiàn)都可能導(dǎo)致所制備的膠原水凝膠不能達(dá)到軟骨與骨組織工程的要求。目前國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)是將膠原水凝膠與相關(guān)干細(xì)胞結(jié)合，期望制備出能夠誘導(dǎo)軟骨與骨細(xì)胞分化，具有更加優(yōu)良修復(fù)效果的膠原水凝膠；同時研究人員也正致力于將交叉學(xué)科和新型材料與膠原水凝膠聯(lián)合，諸如3D 打印技術(shù)[34]、合金材料、陶瓷材料和磁性材料有望與膠原水凝膠結(jié)合，為膠原水凝膠在軟骨與骨組織工程領(lǐng)域的研究注入新的探索方向。

5 總結(jié)與展望

膠原水凝膠因其具有良好的組織相容性和低免疫原性，具備作為軟骨組織工程仿生支架的先天優(yōu)勢，雖然其本身具有機(jī)械強(qiáng)度不夠、熱穩(wěn)定性較差的缺點(diǎn)，但是通過眾多研究者的努力，多種其他生物材料與膠原形交聯(lián)形成的復(fù)合水凝膠具備了不同生物材料間優(yōu)勢并且互補(bǔ)了材料間的短板。膠原與其他生物材料交聯(lián)成的復(fù)合水凝膠，因其良好的生物相容性、低免疫原性，優(yōu)良的生物理化性質(zhì)，作為軟骨組織工程三要素：種子細(xì)胞、支架材料及細(xì)胞因子[32]。并且隨著相關(guān)交叉學(xué)科的發(fā)展，3D 打印技術(shù)、陶瓷材料與復(fù)合水凝膠的結(jié)合的優(yōu)勢也逐漸體現(xiàn)出來，比如通過3D 打印技術(shù)制備的聚乙二醇膠原復(fù)合水凝膠在血管移植方面的探索；納米材料、磁性材料與膠原水凝膠交聯(lián)制備的新型復(fù)合膠原水凝膠在藥物運(yùn)輸[26-27]和軟骨組織修復(fù)方面[28]的研究也在逐漸深入。