過表達SIRT1基因通過PI3K/AKT信號通路抑制高糖刺激心肌H9c2細胞凋亡和活性氧水平*

翟 鐵，郝鳳杰△，田雪品，張宗群

(承德市中心醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)主要是由于機體持續(xù)高糖狀態(tài)導致心臟功能代謝異常，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的一種疾病狀態(tài)[1-3]。既往研究表明，在糖尿病患者和動物模型中心肌細胞表現(xiàn)為凋亡率增加，增殖能力降低，但目前對其分子機制尚不明確[4-5]。近年來的研究表明，細胞中氧化應激損傷是導致糖尿病心肌病發(fā)生的主要原因之一[6]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是一種被廣泛研究的sirtuins家族成員，在機體多種器官中均有表達如大腦、心臟和脂肪組織等，主要存在于細胞核中，對機體多種信號通路的調(diào)節(jié)作用具有重要意義[7-8]。SIRT1調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)發(fā)生脫乙酰化反應，參與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)節(jié)細胞的增殖、氧化應激和新陳代謝等，對代謝性疾病、腫瘤和心臟功能發(fā)揮重要作用[9-10]。本研究探討過表達SIRT1對高糖誘導下心肌 H9c2細胞活力和凋亡的影響，以期為糖尿病心肌病的預防和治療尋找新的思路。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

心肌H9c2細胞購自中科院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；SIRT1過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-SIRT1)和空載質(zhì)粒(pcDNA3.1-NC)購自上海吉瑪有限公司；TRIzol和Lipofectamine 2000購自Invitrogen；細胞凋亡檢測試劑盒、抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體和噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl te-trazolium bromide，MTT)購自上海碧云天生物有限公司；雙氯熒光素(2’，7’-dichlorfluorescein diacetate, DCFH-DA)購自Sigma；抗磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)抗體、抗磷酸化PI3K(p-PI3K)抗體、抗AKT抗體、抗磷酸化AKT(p-AKT)抗體和抗SIRT1抗體購自Santa Cruz。ABI 7900實時熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems；流式細胞儀購自Thermo Fisher Scientific；凝膠成像儀購自Bio-Rad。

2 方法

2.1細胞的培養(yǎng)與分組 心肌 H9c2細胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每2～3 d加入0.25%胰酶消化，加入完全培養(yǎng)基終止消化，按照1∶3或1∶4進行傳代。取生長狀態(tài)良好的細胞，隨機分為對照(control)組(常規(guī)培養(yǎng))和高糖(high glucose,HG)組(加入33 mmol/L葡糖糖刺激24 h)，高糖組又分為3組：高糖+過表達SIRT1(HG+SIRT1)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SIRT1后給予高糖刺激)、高糖+陰性對照(HG+NC)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC后給予高糖刺激)和高糖(HG)組(加入高糖刺激)。

2.2細胞的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h，胰酶消化、計數(shù)心肌 H9c2細胞，接種于24孔板中，采用不含抗生素的培養(yǎng)基稀釋pcDNA3.1-SIRT1和pcDNA3.1-NC，與Lipofectamine 2000混合均勻，37 ℃靜置20 min，加入每孔細胞中，37 ℃孵育5 h，更換為含10%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

2.3qPCR檢測SIRT1的mRNA表達 使用 TRIzol試劑提取細胞中總RNA。微量移液器吸取5 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行擴增反應。SIRT1的上游引物序列為5’-CTTCAGGTCAAGGGATGGTAT-3’，下游引物序列為5’-GCGTGTCTATGTTCTGGGTAT-3’;內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5’-GGGAAATCGTGCGTGACA-3’,下游引物序列為5’-TCAGGAGGAGCAATGATC-3’。置于ABI 7900實時熒光定量PCR儀中進行擴增，條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 8 min，40個循環(huán)。實驗重復3次，采用2-ΔΔCt法計算SIRT1 mRNA的相對表達量。

2.4細胞活力的檢測 將各組細胞以每孔5×103個接種于96孔板上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，加入MTT 20 μL，37 ℃靜置4 h，加入200 μL 二甲基亞砜，37 ℃孵育30 min，酶標儀中檢測細胞570 nm的吸光度(A)值。細胞的活力=(實驗組A570-空白組A570)/(對照組A570-空白組A570)×100%。

2.5細胞凋亡的檢測 收集各組細胞，加入PBS清洗3次，加入胰酶，調(diào)整其密度為1×109/L，吸取0.5 mL細胞懸浮液培養(yǎng)24 h后，每孔加入1.25 μL 膜聯(lián)蛋白 V-FITC和10 μL 碘化丙啶，4 ℃染色過夜，流式細胞術(shù)分析凋亡率。

2.6細胞中活性氧簇 (reactive oxygen species，ROS)的檢測 收集各組心肌 H9c2細胞，接種至24孔板中，待細胞密度為80%左右，每孔加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃培養(yǎng)30 min，熒光顯微鏡下隨機選取5個視野，分析綠色熒光強度，取平均值(mean fluorescence intensity, MFI)，可間接反映ROS水平。

2.7Western blot檢測蛋白水平 收集細胞，加入預冷的PBS緩沖液清洗2次，置于細胞裂解液中30 min，12 000×g離心20 min，收集上清。吸取50 μg總蛋白，采用10% SDS-PAGE分離蛋白，將分離的目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜中，阻斷緩沖液封閉2 h；加入 I 抗，4 ℃過夜，Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液漂洗3次，每次10 min,加入 II 抗，37 ℃孵育2 h，Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液漂洗3次，每次10 min,凝膠成像儀中拍照，Quantity One軟件分析蛋白質(zhì)灰度值，計算蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計處理，結(jié)果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染后心肌H9c2細胞中SIRT1的表達變化

與對照組相比，高糖誘導的心肌 H9c2細胞顯著降低SIRT1的表達量(P<0.05)；與高糖組相比，轉(zhuǎn)染過表達載體顯著增加心肌 H9c2細胞中SIRT1的表達量(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of SIRT1 at mRNA and protein levels in the H9c2 cells after transfection. A: the mRNA expression level of SIRT1 detected by qPCR; B: the protein level of SIRT1 detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖1 轉(zhuǎn)染后心肌H9c2細胞中SIRT1的mRNA 和蛋白表達

2 過表達SIRT1對心肌H9c2細胞活力的影響

MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖誘導的心肌 H9c2細胞的活力顯著降低(P<0.05)；與高糖組相比，過表達SIRT1顯著增加心肌 H9c2細胞的活力(P<0.05)，見圖2。

3 過表達SIRT1對H9c2心肌細胞凋亡率的影響

與對照組相比，高糖誘導顯著提高心肌 H9c2細胞的凋亡率(P<0.05)；過表達SIRT1細胞的凋亡率與對照組相比差異無統(tǒng)計學顯著性；與高糖組相比，過表達SIRT1顯著降低細胞凋亡率(P<0.05),見圖3。

Figure 2.The effect ofSIRT1over-expression on the viability of H9c2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖2 過表達SIRT1對心肌 H9c2細胞活力的影響

Figure 3.The effect ofSIRT1over-expression on the apoptotic rate of H9c2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖3 過表達SIRT1對心肌H9c2細胞凋亡率的影響

4 過表達SIRT1對心肌 H9c2細胞ROS生成的影響

與對照組相比，高糖誘導顯著提高心肌 H9c2細胞中ROS的水平，過表達SIRT1的細胞與對照組相比差異無統(tǒng)計學顯著性；與高糖組相比，過表達SIRT1顯著降低細胞中ROS的水平(P<0.05),見圖4。

5 過表達SIRT1對PI3K/AKT蛋白水平和磷酸化的影響

Western blot結(jié)果顯示，各組間心肌 H9c2細胞中PI3K和AKT總蛋白的水平變化差異無統(tǒng)計學顯著性；與對照組相比，高糖誘導顯著降低PI3K和AKT磷酸化蛋白的水平(P<0.05)，過表達SIRT1對細胞中PI3K和AKT磷酸化蛋白的水平無顯著影響；與高糖組相比，過表達SIRT1顯著增加PI3K和AKT磷酸化蛋白的水平(P<0.05)，見圖5。

Figure 4.The effect ofSIRT1over-expression on the production of ROS in the H9c2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖4 過表達SIRT1對心肌H9c2細胞生成ROS的影響

Figure 5.The effect ofSIRT1over-expression on the protein levels of PI3K/AKT signaling pathway-related molecules in the H9c2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖5 過表達SIRT1對PI3K/AKT信號通路相關(guān)分子蛋白水平的影響

討 論

心肌細胞凋亡率升高和存活率下降是多種心血管疾病發(fā)生的主要特征之一[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者心肌細胞凋亡的增加和壞死等導致心肌結(jié)構(gòu)的變化，嚴重下調(diào)心臟的代償能力，阻礙心臟的泵血功能[13-14]。心肌細胞凋亡在糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，糖尿病心肌病患者的心肌細胞更易發(fā)生壞死和凋亡。SIRT1是一種組蛋白脫乙?；福D(zhuǎn)移DNA組蛋白賴氨酸N端乙?；⒄{(diào)控轉(zhuǎn)錄過程，參與細胞的增殖、凋亡、氧化應激、糖尿病細胞的新陳代謝等[15-18]。在糖尿病大鼠模型中，SIRT1通過調(diào)節(jié)S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的水平參與糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展[9]，表明SIRT1在DCM過程中起重要作用。因此SIRT1在臨床治療DCM中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在心臟和血管等細胞異常增殖的治療中具有很好的前景。在本實驗中，高糖誘導的心肌細胞中SIRT1的表達量降低，共轉(zhuǎn)染過表達載體顯著增加高糖誘導的心肌細胞中SIRT1的表達量；過表達SIRT1促進高糖刺激的心肌 H9c2細胞的活性，抑制細胞的凋亡，降低細胞中ROS的累積。既往研究表明，SIRT1可抑制心肌細胞的凋亡，白藜蘆醇顯著增加SIRT1的表達量，減少高糖誘導的心肌細胞凋亡[19-20]，與本實驗研究結(jié)果相似。

氧化應激在DCM病變過程中起關(guān)鍵作用，損害心血管系統(tǒng)和微血管結(jié)構(gòu)的改變。糖尿病患者持續(xù)的高糖環(huán)境導致細胞代謝紊亂，促進血管內(nèi)皮、微血管、心肌細胞中線粒體過氧化產(chǎn)物的積累，從而增加細胞內(nèi)活性氧水平，活性氧的產(chǎn)物通過促進細胞凋亡或者激活細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路導致心肌細胞損傷，還可直接調(diào)節(jié)細胞DNA損傷以及損傷修復機制的活化，從而增強活性氧誘導的細胞凋亡過程，最終導致糖尿病心肌病的心臟功能和結(jié)構(gòu)障礙[21]。在糖尿病心肌細胞的氧化應激過程中，由多種信號通路的參與，如PI3K/AKT和核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)等信號通路。研究表明SIRT1可通過PI3K/AKT信號通路參與細胞的增殖和凋亡過程[22]。因此本實驗通過Western blot檢測心肌 H9c2細胞中PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵蛋白的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞中總蛋白水平無顯著變化，但PI3K和AKT的磷酸化水平在高糖的誘導下顯著降低，過表達SIRT1可升高PI3K和AKT的磷酸化水平，表明SIRT1可能通過PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)心肌 H9c2細胞凋亡和氧化應激。

綜上所述，過表達SIRT1可增加高糖誘導的心肌 H9c2細胞活性，降低其凋亡率和氧化應激反應，可能通過影響PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用，為糖尿病心肌病的治療提供實驗依據(jù)。