異蓮心堿對小鼠離體氣管平滑肌的舒張作用*

劉貝貝，陳微微，張雯婧，劉慶華

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物研究所 & 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430074)

過敏性哮喘是一種慢性呼吸道疾病[1]。氣管平滑肌細胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)是呼吸系統(tǒng)中一種重要的細胞類型，參與哮喘的發(fā)生。ASMCs過度收縮會導(dǎo)致氣道管腔狹窄，限制氣體交換，嚴重時可威脅哮喘患者的生命[2]。ASMCs的收縮和舒張與細胞內(nèi)Ca2+濃度密切相關(guān)，Ca2+濃度受鈣通道影響，如L型電壓依賴性鈣通道(L-type voltage-dependent Ca2+channel，LVDCC)和鈣庫操縱性鈣通道[3]。已有研究表明，LVDCC的選擇性抑制劑硝苯地平(nifedipine)可以有效緩解哮喘患者癥狀[4]。目前臨床上治療哮喘多以化學(xué)藥物(如β2腎上腺素能激動劑)為主，但長期使用容易產(chǎn)生藥物依賴性等副作用[5]。而中國的傳統(tǒng)中藥由于其毒副作用相對較小，安全性高，逐漸受到人們關(guān)注。本課題嘗試從中藥成分中尋找更合適的治療哮喘新藥。

異蓮心堿(isoliensinine)，一種雙芐基喹啉生物堿單體，是中藥蓮子心的一種活性成分[6]。異蓮心堿在心血管疾病方面的藥理作用研究較多，發(fā)現(xiàn)其具有阻滯鈣通道、抗心律失常、抗高血壓和心肌肥厚以及抗血小板凝集等作用[7-8]。此外，異蓮心堿在抗氧化、抗腫瘤和抗細胞增殖等方面亦有一定作用[9-10]。鑒于異蓮心堿對心肌和血管平滑肌具有廣泛的舒張作用，我們推測它對氣管平滑肌(airway smooth muscle，ASM)也可能具有舒張作用。因此，本研究嘗試探究異蓮心堿對高K+誘導(dǎo)預(yù)收縮的小鼠離體ASM的舒張作用及其機制。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF級BALB/c小鼠，雄性，6～8周齡，體重18～20 g，購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心，許可證號為SCXK(鄂)2015-0019。飼養(yǎng)于中南民族大學(xué)實驗動物中心1周后用于實驗。

2 主要試劑

異蓮心堿單體購自中國藥品生物制品檢定所；氯化四乙胺、HEPES、硝苯地平、DMSO、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶、牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)和Mg-ATP均購自Sigma；Fura-2/AM購自Invitrogen。

3 主要儀器

JH-2型張力換能器(成都泰盟)；HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)(成都泰盟)；EPC-10膜片鉗放大器(HEKA)；鈣成像系統(tǒng)(TILL Photonics)。

4 方法

4.1氣管環(huán)張力的測量 體外分離小鼠氣管環(huán)，利用張力換能器測ASM張力[11-12]。小鼠處死后迅速分離出氣管，并快速轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的PSS生理溶液中。PSS(mmol/L)：135 NaCl、5 KCl、1 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES、10葡萄糖，pH 7.40。從氣管底部剪取一段氣管環(huán)(約5 mm)，將其懸掛于灌流槽中，一端連接張力換能器，灌流槽盛有PSS，并維持37 ℃、通氧。平衡60 min后，利用高K+(PSS中含80 mmol/L K+)預(yù)刺激3次，使氣管環(huán)到達最佳收縮狀態(tài)，然后開始正式實驗。計算氣管環(huán)的舒張比率,氣管環(huán)的舒張比率(%)=(加入激動劑后平臺期張力值-加入某濃度藥物后平臺期張力值)/(加入激動劑后平臺期張力值-靜息張力值)×100%。

4.2單個氣管平滑肌細胞的分離 按參考文獻中的方法分離小鼠ASMCs[13-14]。分離小鼠氣管并將其轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的ASM解離液中。解離液(mmol/L)：120 NaCl、1.2 MgCl2、0.1 CaCl2、5.2 KCl、10 HEPES、11葡萄糖、0.6 KH2PO4、25 NaHCO3，pH 7.10。在體式顯微鏡下進一步分離得到ASM肌條，然后將ASM肌條轉(zhuǎn)移至2 g/L木瓜蛋白酶消化液中，35 ℃水浴孵育25 min，其間輕微振蕩2～3次。之后將肌條轉(zhuǎn)移至1 g/L膠原蛋白酶消化液中，35 ℃水浴孵育7 min。最后，將酶解好的肌條轉(zhuǎn)移到1 g/L BSA溶液中，洗脫2次后輕輕吹打使單個細胞釋出，置于0 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.3LVDCC電流的測量 以Ba2+為電荷載體，利用膜片鉗放大器記錄LVDCC電流[15]。細胞外液(mmol/L)：105 NaCl、6 CsCl、27.5 BaCl2、11葡萄糖、10 HEPES、10 TEA-Cl，pH 7.40。電極內(nèi)液(mmol/L)：130 CsCl、10 EGTA、4 MgCl2、4 Mg-ATP、10 HEPES，pH 7.40。全細胞記錄程序：鉗制電壓為-70 mV，從-70 mV去極化至+40 mV，去極化時間為500 ms，每10 s增加10 mV。電流利用PatchMaster軟件分析。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Origin 8.0軟件(OriginLab)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。兩組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 異蓮心堿對高K+誘導(dǎo)的小鼠離體ASM預(yù)收縮的舒張作用

高K+可誘導(dǎo)細胞膜去極化，LVDCC通道開放，胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致ASM發(fā)生收縮[17]。加入高K+溶液后，張力迅速上升，待張力穩(wěn)定后，加入異蓮心堿，使其濃度依次達到0.316、1、3.16、10、31.6和100 μmol/L，張力隨著異蓮心堿濃度的遞增而遞減，當(dāng)濃度達到100 μmol/L時，張力降低至高K+預(yù)收縮前的基線水平，見圖1A。在對照實驗中，舒張現(xiàn)象不明顯,見圖1B?；诹啃€，異蓮心堿的最大舒張比率為(95.3±3.9)%，IC50值為(21.2±4.0)μmol/L，其誘發(fā)的舒張明顯大于對照組(P<0.01)，見圖1C。高K+誘導(dǎo)的預(yù)收縮也可被硝苯地平(LVDCC抑制劑)抑制，最大舒張百分比為(97.4±1.4)%，見圖1D。然而，異蓮心堿對靜息狀態(tài)下的ASM沒有舒張作用,見圖1E。

Figure 1.The effect of isoliensinine on high K+-induced precontraction in ASM. A: a tracheal ring was contracted by high K+, which was inhibited by isoliensinine in a dose-dependent manner; B: a control experiment; C: the dose-relaxation curves; D: the high K+-induced contraction was inhibited by nifedipine in tracheal ring; E: isoliensinine had no effect on the resting tension in tracheal ring. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsvehicle group.

圖1 異蓮心堿對高K+誘導(dǎo)預(yù)收縮ASM的影響

2 異蓮心堿阻斷LVDCC電流

為了進一步驗證異蓮心堿對ASMCs膜上Ca2+通道的影響，我們利用膜片鉗全細胞記錄技術(shù)檢測了異蓮心堿對LVDCC電流的影響。結(jié)果表明，當(dāng)電壓達到-20 mV時，LVDCC開始激活，介導(dǎo)內(nèi)向電流，隨著電壓升高，內(nèi)向電流逐漸增大，當(dāng)電壓為+10 mV時，電流達到峰值，然后隨著電壓的升高，電流逐漸減小。當(dāng)加入異蓮心堿或硝苯地平后，LVDCC電流完全消失,見圖2。這些結(jié)果表明異蓮心堿與硝苯地平均可阻斷LVDCC電流。

3 異蓮心堿對高K+引起的ASMCs[Ca2+]i升高的影響

利用鈣成像系統(tǒng)檢測ASMCs [Ca2+]i變化，其值由Ca2+熒光探針Fura-2的340/380 nm熒光信號比值代表。靜息狀態(tài)時[Ca2+]i維持在比較低的水平，加入高K+后，[Ca2+]i迅速升高，隨之下降到一個平臺期，當(dāng)加入異蓮心堿(100 μmol/L)后[Ca2+]i降低至基線。異蓮心堿加入前Fura-2的340/380 nm熒光信號比為0.63±0.10，加入后為0.36±0.05(P<0.01),見圖3A。如果在[Ca2+]i最高點加入異蓮心堿(100 μmol/L)也可導(dǎo)致[Ca2+]i快速降低至基線。加藥后340/380 nm熒光信號比由0.74±0.02降至0.42±0.05(P<0.01)，見圖3B。這些結(jié)果提示異蓮心堿可抑制LVDCC介導(dǎo)的[Ca2+]i升高。

Figure 2.The effect of isoliensinine on LVDCC-mediated currents. A: the protocol used to measure LVDCC currents; B: LVDCC currents were recorded, which were abolished by isoliensinine and nifedipine, respectively; C:I-Vcurves were plotted. Mean±SEM.n=6.

圖2 異蓮心堿對LVDCC電流的影響

Figure 3.Isoliensinine inhibits high K+-induced [Ca2+]iincreases. A: high K+induced a sustained increase of [Ca2+]iin a tracheal smooth muscle cell, which was inhibited by isoliensinine. The amplitudes at sites a1and b1were calculated. Mean±SEM.n=15.**P<0.01vsa1group. B: the same experiments and analysis were performed, except isoliensinine was added at the peak point of [Ca2+]i, the amplitudes at sites a2and b2were calculated also. Mean±SEM.n=18.##P<0.01vsa2group.

圖3 異蓮心堿抑制高K+誘導(dǎo)的[Ca2+]i升高

4 異蓮心堿抑制Ca2+內(nèi)流觸發(fā)的收縮

高K+導(dǎo)致膜電位去極化，激活LVDCC，介導(dǎo)Ca2+由胞外流入胞內(nèi)。異蓮心堿是否抑制高K+引起的Ca2+內(nèi)流呢？在細胞外Ca2+為0的條件下(PSS中不含Ca2+但含0.5 mmol/L EGTA)，高K+不能誘導(dǎo)ASM收縮，而當(dāng)Ca2+濃度恢復(fù)到2 mmol/L后，ASM立即收縮，最大收縮百分比為(107.4±6.6)%，而異蓮心堿加入后，收縮被抑制,見圖4A，最大抑制百分比為(86.2±4.7)%，見圖4C。利用異蓮心堿重復(fù)上面的實驗，2 mmol/L Ca2+僅誘發(fā)小幅度的收縮，見圖4B，其最大收縮百分比為(13.1±8.3)%，見圖4C。兩最大收縮百分比之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。這些結(jié)果證明異蓮心堿抑制高K+引起的Ca2+內(nèi)流。

Figure 4.The effect of isoliensinine on Ca2+influx induced by high K+. A: under Ca2+free conditions, high K+failed to induce a contraction in a tracheal ring. Following the addition of 2 mmol/L Ca2+, a contraction (the amplitude is represented by “a3”) occurred and then inhibited by isoliensinine; B: in the presence of isoliensinine, 2 mmol/L Ca2+-induced contraction was markedly inhibited. The amplitude is represented by “b3”; C: the summary results. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsa3group.

圖4 異蓮心堿對高K+誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流的影響

討 論

氣道高反應(yīng)是哮喘的典型病理特征之一，本質(zhì)上是由于ASM異常過度收縮所致[18]。目前利用藥物抑制ASM收縮是緩解哮喘癥狀的一種有效治療方法。ASM收縮反應(yīng)與[Ca2+]i密切相關(guān)，胞質(zhì)中的Ca2+與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，進而誘發(fā)ASM的收縮，而[Ca2+]i可受控于Ca2+通道的開放和關(guān)閉，其中LVDCC是一種介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流的通道[19-20]。因此，可利用體外實驗篩選LVDCC的抑制劑，作為新的氣管擴張劑的前體。

生物堿普遍存在于動物、植物和微生物等生物有機體中，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同可分為異喹啉類、喹啉類和吲哚類等[21]。大多數(shù)生物堿具有抗炎、降低血壓等多種藥理學(xué)作用[22]。異蓮心堿屬于喹啉類生物堿單體，具有舒張心肌和腸系膜血管平滑肌的作用[23]，但在舒張ASM方面尚未見報道。本研究利用高K+作為激動劑刺激ASM收縮，體外模擬哮喘發(fā)病時的氣管過度收縮，探究異蓮心堿是否可舒張收縮的ASM，同時探究其作用機理。實驗結(jié)果表明：在組織水平，異蓮心堿不改變靜息狀態(tài)下的ASM張力，但可以舒張高K+預(yù)收縮的ASM，且舒張作用表現(xiàn)出劑量依賴性；在細胞水平，異蓮心堿完全阻斷LVDCC電流，同時顯著降低高K+誘導(dǎo)升高的[Ca2+]i，抑制細胞外Ca2+流入胞內(nèi)誘發(fā)的收縮。

綜上所述，異蓮心堿可抑制LVDCC通道，其介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流停止，[Ca2+]i降低，導(dǎo)致ASM舒張。本研究結(jié)果提示異蓮心堿可被開發(fā)為新的氣管擴張劑。