橙皮素通過(guò)抑制鈣超載減輕低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞凋亡*

曾先燕，張妞妞，吉曄楠，王文麗，賀忠梅

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001)

缺血性心臟病(ischemic heart disease)是患病率與死亡率很高的一種疾病,心臟再灌注是目前主要的治療手段[1]。但在血流恢復(fù)過(guò)程中會(huì)使組織和器官的損傷加重，甚至危及生命，故將這種損傷稱(chēng)為缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/RI)[2]。I/RI有多種機(jī)制，比如大量自由基產(chǎn)生、早期炎癥細(xì)胞因子釋放、鈣超載以及線(xiàn)粒體功能障礙等，其中鈣超載是導(dǎo)致細(xì)胞不可逆損傷的重要因素[3]。越來(lái)越多的流行病學(xué)研究報(bào)告指出，富含草藥、水果和香料的飲食可以降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。橙皮素(hesperetin, HES)來(lái)源于蕓香科柑橘類(lèi)植物果實(shí)，它的主要藥效成分是生物黃烷酮類(lèi)，是橙皮苷的活性代謝產(chǎn)物，其生物學(xué)活性包括抗炎、抗腫瘤、抗過(guò)敏和抗氧化等[5]。近幾年研究表明，橙皮素對(duì)視網(wǎng)膜、腦及其它器官的缺血再灌注損傷有保護(hù)效應(yīng)[6]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素能減輕H2O2誘導(dǎo)的心肌 H9c2細(xì)胞氧化損傷[7]，而橙皮素預(yù)處理對(duì)低氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)誘導(dǎo)的心肌 H9c2細(xì)胞凋亡是否有影響尚不清楚。本文研究的主要目的是觀(guān)察橙皮素對(duì)H/R誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用并探討其可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠心肌H9c2細(xì)胞購(gòu)自上海生命科學(xué)院。胎牛血清購(gòu)自BI；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；100×青霉素-鏈霉素溶液和0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；橙皮素和尼莫地平(nimodipine, Nim)均購(gòu)自Sigma；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Ca2+GPCR分析-鈣離子指示探針和JC-1試劑盒均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Ca2+-ATP酶ELISA試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑PMSF、凝膠配制試劑盒和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；線(xiàn)粒體分離試劑、ATP檢測(cè)試劑盒和RIPA裂解液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；0.45 μm PVDF膜購(gòu)自Millipore；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊兔IgG和抗β-actin抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司；抗電壓依賴(lài)性陰離子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)抗體購(gòu)自CST；抗Bcl-2、Bax和細(xì)胞色素C(cytochrome C, Cyt-C)抗體均購(gòu)自Abcam。

2 主要方法

2.1采用CCK-8法與乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒分別檢測(cè)細(xì)胞的活力與壞死情況 細(xì)胞密度大約為5.0×106/L接種于96孔板，低氧12 h，復(fù)氧0 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h，每組設(shè)6個(gè)平行孔，根據(jù)CCK-8試劑盒測(cè)定的細(xì)胞存活率，選擇最佳的低氧/復(fù)氧時(shí)點(diǎn)；在低氧/復(fù)氧時(shí)點(diǎn)進(jìn)行不同濃度(6、12、25、50和100 μmol/L)的橙皮素預(yù)處理4 h；同理根據(jù)CCK-8法和LDH測(cè)定的細(xì)胞活力和壞死情況，確定橙皮素最佳濃度。

2.2實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為常氧對(duì)照(control)組、H/R組、HES+H/R組、Nim+H/R組和HES組。在6孔板里培養(yǎng)心肌H9c2細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，橙皮素組培養(yǎng)液中含橙皮素濃度25 μmol/L，預(yù)處理4 h；10 μmol/L尼莫地平預(yù)處理1 h；正常對(duì)照組置于37 ℃、5% CO2的孵箱培養(yǎng)15 h；低氧/復(fù)氧組換成低糖培養(yǎng)基后置于37 ℃、1% O2、99% N2的低氧孵箱培養(yǎng)12 h，再次換液成10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)，復(fù)氧置于37 ℃、5% CO2、95%空氣的孵箱培養(yǎng)3 h。

2.3Caspase-3活性與ATP水平的檢測(cè) 正常狀態(tài)下caspase-3沒(méi)有活性，在胞漿中以酶原形式存在，而在細(xì)胞凋亡時(shí)caspase-3被激活；活化狀態(tài)的caspase-3由2個(gè)大亞基及2個(gè)小亞基組成，引起胞核底物降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。將樣本從-80 ℃取出，按照說(shuō)明書(shū)比例加入裂解液，冰上裂解30 min，在4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清液到新的EP管，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，通過(guò)A誘導(dǎo)劑/A陰性對(duì)照的倍數(shù)來(lái)確定caspase-3活化的程度；細(xì)胞處理好后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作裂解并離心，取上清液，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A)值，BCA法測(cè)定各組蛋白濃度，進(jìn)而檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)各組ATP水平。

2.4線(xiàn)粒體與胞漿蛋白的分離 細(xì)胞造模完成，收集細(xì)胞，使用線(xiàn)粒體分離試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，加入100 μL線(xiàn)粒體分離試劑4 ℃ 離心15 s再加入預(yù)冷線(xiàn)粒體分離試劑冰上玻璃勻漿器均勻化30次。勻漿完后在4 ℃、600 ×g離心10 min，去除細(xì)胞核和未破裂的細(xì)胞。然后上清液收集并離心4 ℃、12 000 ×g離心10 min，獲得胞漿(上清液)和線(xiàn)粒體(沉積)部分。得到的線(xiàn)粒體溶解在裂解緩沖液中儲(chǔ)存。

2.5ELISA測(cè)心肌 H9c2細(xì)胞Ca2+-ATP酶含量 細(xì)胞收集后用PBS稀釋細(xì)胞懸液，通過(guò)反復(fù)凍融，3 000 r/min離心20 min并收集上清，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)出心肌 H9c2細(xì)胞Ca2+-ATP酶含量。

2.6Fluo-3AM染色 細(xì)胞接種于6孔板里，細(xì)胞模型建立完成后按照Ca2+GPCR分析-鈣離子指示探針試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，配制Fluo-3AM稀釋液濃度為10 μmol/L，每孔加入1 mL染液，在37 ℃避光孵育40 min，之后去掉染液，PBS漂洗2次，采用熒光顯微鏡進(jìn)行熒光圖像采集。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡、鈣離子的熒光強(qiáng)度及線(xiàn)粒體膜電位 細(xì)胞處理后去掉培養(yǎng)液，加入不含EDTA胰蛋白酶消化細(xì)胞，800 r/min離心5 min并收集細(xì)胞，PBS洗3次，加入200 μL Binding Buf-fer，之后再加入5 μL AnnexinV-FITC與5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混勻，室溫避光20 min，混勻后使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)；在細(xì)胞處理后去掉培養(yǎng)液，采用Fluo-3AM進(jìn)行染色，在37 ℃下避光孵育40 min，再加入不含EDTA胰蛋白酶消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)速800 r/min離心5 min收集細(xì)胞，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Ca2+的熒光強(qiáng)度值；細(xì)胞處理后收集細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書(shū)配比例加入JC-1試劑混合液400 μL 37 ℃烘箱避光30 min，1 000 r/min離心5 min去掉上清加入200 μL buffer重懸細(xì)胞,上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

2.8Western blot分析 從-80 ℃取出樣本，加入RIPA裂解液(含PMSF)提取總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，取等質(zhì)量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后將蛋白半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，Ⅰ 抗4 ℃過(guò)夜孵育(Bcl-2 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Cyt-C 1∶200、β-actin 1∶2 000、VDAC 1∶1 000稀釋)，Ⅱ 抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h，洗脫后用超敏ECL發(fā)光液顯色，使用UVP凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，ImageJ軟件分析條帶的灰度值，則目的蛋白灰度值與內(nèi)參照蛋白灰度值的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。多組資料比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較多采用SKN-q法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心肌 H9c2細(xì)胞低氧/復(fù)氧模型的建立與橙皮素最佳濃度確定

與control組相比，低氧12 h/復(fù)氧3 h細(xì)胞相對(duì)活力下降到50%左右(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。給予不同濃度橙皮素0、6、12、25、50和100 μmol/L預(yù)處理心肌H9c2細(xì)胞，與0 μmol/L相比，25 μmol/L的HES可使H/R后的細(xì)胞活力顯著升高，LDH釋放顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1B、C。因此，以低氧12 h/復(fù)氧3 h和橙皮素濃度25 μmol/L作為最佳條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 1.Optimal time point and HES concentration for H/R in the H9c2 cells. A: the viability of H9c2 cells was measured by CCK-8 assay at different reoxgenation time points; B and C: the effects of pretreatment with different doses of HES on H/R-induced cell viability (detected by CCK-8 assay) and cell death (detected by extracellular LDH assay). Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs0 h;△P<0.05vs0 μmol/L.

圖1 低氧復(fù)氧最佳時(shí)點(diǎn)與橙皮素最佳濃度的確定

2 橙皮素減輕H/R誘導(dǎo)心肌 H9c2細(xì)胞凋亡

Hoechst 33258染色與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與control組相比，H/R組明亮的藍(lán)色細(xì)胞核明顯增加，無(wú)論早期細(xì)胞凋亡率還是晚期細(xì)胞凋亡率均明顯升高;而與H/R組比，HES+H/R組明亮藍(lán)色的細(xì)胞核減少，凋亡率明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2A、2B。此外，caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與control組相比，H/R組的caspase-3活性明顯增加；給予橙皮素預(yù)處理后caspase-3活性顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2C。這些結(jié)果表明橙皮素可減少H/R后的心肌H9c2細(xì)胞凋亡。

Figure 2.The effects of HES on H/R-induced apoptosis of the H9c2 cells. A and B: the apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining (scale bar=100 μm) and flow cytometry; C: the caspase-3 activity was assayed. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖2 橙皮素對(duì)低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌 H9c2細(xì)胞凋亡的影響

3 橙皮素可抑制低H/R誘導(dǎo)的心肌 H9c2細(xì)胞鈣離子超載

采用細(xì)胞內(nèi)Ca2+GPCR分析-鈣離子指示探針檢測(cè)，F(xiàn)luo-3AM孵育后用熒光顯微鏡與流式細(xì)胞術(shù)觀(guān)察心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度變化。結(jié)果顯示，與control組相比，H/R組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；相比H/R組，HES+H/R組細(xì)胞內(nèi)鈣離子強(qiáng)度降低，見(jiàn)圖3A。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分析，與control組相比，H/R組鈣離子熒光強(qiáng)度值明顯增加(P<0.05), HES+H/R組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度值較H/R組降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3B。以上結(jié)果表明橙皮素通過(guò)降低鈣超載減少H/R后的心肌 H9c2細(xì)胞凋亡。

Figure 3.HES decreased H/R-induced calcium overload in the H9c2 cells. Intracellular Ca2+was measured by Fluo3-AM staining, and the fluorescence intensity was analyzed by fluorescence microscopy (A) and flow cytometry (B). The scale bar=100 μm. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖3 橙皮素降低低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌 H9c2細(xì)胞鈣離子超載

4 橙皮素提高H/R誘導(dǎo)的心肌 H9c2細(xì)胞Ca2+-ATP酶活性

胞質(zhì)內(nèi)鈣的排出是由細(xì)胞膜或者肌質(zhì)網(wǎng)及線(xiàn)粒體膜上Ca2+-ATP酶來(lái)完成，因此我們檢測(cè)Ca2+-ATP酶活性。ELISA結(jié)果顯示，與control組相比，H/R組細(xì)胞膜Ca2+-ATP酶活性明顯降低(P<0.05)；與H/R組相比，給予橙皮素預(yù)處理后細(xì)胞膜Ca2+-ATP酶活性顯著得以恢復(fù)(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

5 橙皮素能逆轉(zhuǎn)H/R誘導(dǎo)心肌 H9c2細(xì)胞線(xiàn)粒體功能障礙

我們通過(guò)測(cè)定線(xiàn)粒體膜電位及ATP含量以反映線(xiàn)粒體功能。JC-1染色后行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，正常細(xì)胞位于R2門(mén)框外，居R2門(mén)框內(nèi)的橙紅色細(xì)胞代表發(fā)生凋亡的細(xì)胞，細(xì)胞下移數(shù)量可反映線(xiàn)粒體膜電位下降水平。結(jié)果顯示與control組比，H/R組R2門(mén)框中橙紅色熒光細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)；與H/R組相比，HES+H/R組R2門(mén)框中橙紅色熒光細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)；給予鈣離子拮抗劑尼莫地平(Nim)后，R2門(mén)框中橙紅色熒光細(xì)胞數(shù)則較H/R組有所減少(P<0.05),見(jiàn)圖5A。ATP含量測(cè)定結(jié)果顯示：與control組相比，H/R組心肌 H9c2 細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯下降(P<0.05)；與H/R組比，HES+H/R組與Nim+H/R組則增加細(xì)胞內(nèi)的ATP水平(P<0.05)，見(jiàn)圖5B。以上結(jié)果表明橙皮素減輕H/R后的細(xì)胞凋亡，并與抑制鈣超載從而改善線(xiàn)粒體功能障礙有關(guān)。

Figure 4.HES elevated H/R-induced calcium-ATPase activity. The Ca2+-ATPase activity was analyzed by ELISA assay. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖4 橙皮素升高低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌 H9c2細(xì)胞Ca2+-ATP酶活性

Figure 5.HES and Nim improved H/R-induced mitochondria function. A: mitochondrial transmembrane potential was analyzed by flow cytometry; B: the level of ATP was measured by microplate reader. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖5 橙皮素與尼莫地平改善低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體功能

6 橙皮素能逆轉(zhuǎn)H/R誘導(dǎo)的心肌 H9c2細(xì)胞線(xiàn)粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加

利用Western blot法檢測(cè)線(xiàn)粒體蛋白Bcl-2、Bax和Cyt-C的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與control組相比，H/R組Bcl-2/Bax比值明顯下降，胞漿Cyt-C蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與H/R組相比，HES+H/R組與Nim+H/R組均明顯上調(diào)Bcl-2/Bax比值，同時(shí)胞漿Cyt-C蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖6。該結(jié)果表明橙皮素與尼莫地平預(yù)處理能降低線(xiàn)粒體凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。

Figure 6.HES and Nim inhibited the expression of mitochondrial apoptosis-related proteins. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖6 橙皮素和尼莫地平抑制線(xiàn)粒體凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)

討 論

細(xì)胞凋亡是缺血性心臟病重要的病理改變。心肌缺血再灌注損傷中心肌細(xì)胞凋亡與鈣超載密切相關(guān)，再灌注時(shí)，心肌細(xì)胞膜上Ca2+-ATP酶活性下降導(dǎo)致胞漿內(nèi)Ca2+明顯升高，引起鈣超載[8]。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，不僅可激活磷脂酶使細(xì)胞及細(xì)胞器的生物膜結(jié)構(gòu)破壞，而且能夠降解膜磷脂生成花生四烯酸和溶血卵磷脂，加重細(xì)胞功能紊亂，激活蛋白酶促進(jìn)結(jié)構(gòu)蛋白的分解[9]。研究表明銀杏葉其成分為黃酮苷類(lèi)，其作用是抑制慢鈣通道縮短APD50和APD90，縮短有效不應(yīng)期，發(fā)揮抗心律失常的作用[10]。橙皮素其主要成分為黃烷酮類(lèi)，本研究結(jié)果顯示橙皮素對(duì)H/R誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載有抑制作用，并增加心肌細(xì)胞膜Ca2+-ATP酶活性從而改善細(xì)胞凋亡。

線(xiàn)粒體是細(xì)胞的能量工廠(chǎng)，文獻(xiàn)報(bào)道心肌缺血再灌注會(huì)引起心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙，從而引起心肌細(xì)胞能量減少[9]。線(xiàn)粒體膜電位降低啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是細(xì)胞凋亡的一個(gè)早期特征[11]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)線(xiàn)粒體膜電位及ATP進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)橙皮素逆轉(zhuǎn)H/R誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜電位下降并提升ATP，同時(shí)給予鈣離子拮抗劑尼莫地平同樣可逆轉(zhuǎn)H/R后的心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位降低。以上結(jié)果說(shuō)明橙皮素是通過(guò)降低鈣超載而改善線(xiàn)粒體功能的。有研究表明，橙皮素通過(guò)減輕JNK-Bax線(xiàn)粒體凋亡途徑，發(fā)揮對(duì)脂多糖誘導(dǎo)心肌H9c2 細(xì)胞的保護(hù)作用[12]。當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)，線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一些明顯變化，例如線(xiàn)粒體凋亡蛋白Cyt-C等釋放于胞漿內(nèi)，線(xiàn)粒體凋亡途徑中凋亡分子的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Bcl-2家族包括許多抗凋亡蛋白(例如Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w)及某些促凋亡蛋白(例如Bax、Bak和Bid)被激活表達(dá)[13-14]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)橙皮素上調(diào)Bcl-2/Bax比值及減少線(xiàn)粒體Cyt-C釋放到胞漿。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立心肌 H9c2細(xì)胞低氧/復(fù)氧模型，觀(guān)察橙皮素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示橙皮素可明顯減少H/R后的心肌 H9c2 細(xì)胞凋亡率，同時(shí)對(duì)胞內(nèi)鈣離子超載有抑制作用，可改善線(xiàn)粒體功能及降低線(xiàn)粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；給予鈣離子拮抗劑尼莫地平，同樣減輕H/R誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體功能障礙。可見(jiàn)橙皮素減少H/R誘導(dǎo)的心肌 H9c2細(xì)胞凋亡與降低鈣離子超載從而改善線(xiàn)粒體功能有關(guān)。本研究為冠心病術(shù)后并發(fā)癥治療提供新的方向。由于Ca2+調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，完全闡釋橙皮素對(duì)Ca2+超載的作用，還需進(jìn)一步探究其具體的通路和上下游關(guān)系。