膿毒癥相關(guān)性腦病小鼠模型的建立及其認(rèn)知功能障礙的初步研究*

藍(lán) 欣, 肖 書(shū)▲，張家瑋，程小鳳，趙佳儀，王華東，陸大祥，朱麗紅△

(暨南大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，2附屬第一醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632)

膿毒癥相關(guān)性腦病(sepsis-associated encephalo-pathy, SAE)，又稱膿毒性腦病，是由膿毒癥所致的全身炎癥反應(yīng)所引起的一種彌漫性腦功能障礙，是膿毒血癥的嚴(yán)重并發(fā)癥之一[1]。SAE以注意力不集中和譫妄甚至昏迷等不同程度的腦功能障礙為主要臨床特征[2]，可導(dǎo)致膿毒癥患者死亡率增加，同時(shí)伴有行為、認(rèn)知、意識(shí)狀態(tài)和知覺(jué)等改變，并且膿毒癥患者預(yù)后往往出現(xiàn)長(zhǎng)期認(rèn)知障礙等后遺癥。目前臨床上對(duì)于SAE的診斷與治療尚未有特異性方法，因而膿毒癥腦病患者的生存率以及預(yù)后生存質(zhì)量較差[3]。因此SAE的診斷治療和預(yù)后改善是醫(yī)學(xué)界面臨的重大難題。

SAE發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，尚未完全清楚。相關(guān)研究顯示，SAE可能與細(xì)菌直接侵襲和內(nèi)毒素的作用、腦血流量改變[4]、腦缺血或血腦屏障功能障礙[5]、神經(jīng)炎癥[6]、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、線粒體功能障礙及氨基酸比例失調(diào)等機(jī)制有關(guān)[7]。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥相關(guān)性腦病的病死率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于膿毒癥無(wú)腦病患者，因此SAE已成為近年危重癥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。

動(dòng)物疾病模型是研究疾病發(fā)病機(jī)制和防治的重要基礎(chǔ)，因此建立一個(gè)合理穩(wěn)定可重復(fù)的動(dòng)物疾病模型對(duì)于SAE的發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究有重要的意義。成功復(fù)制SAE的動(dòng)物模型，可為探索SAE的發(fā)病機(jī)制和治療手段提供可行性和便捷性。盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture, CLP)是膿毒癥研究的金標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)結(jié)扎盲腸近端，用無(wú)菌針在結(jié)扎盲腸末端貫穿穿孔[8]，模擬臨床上腸穿孔誘導(dǎo)腹膜炎的發(fā)病過(guò)程，造成腹腔內(nèi)感染導(dǎo)致全身性炎癥[9]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)，觀察C57BL/6J小鼠術(shù)后生存率、體重和神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分改變，采用水迷宮實(shí)驗(yàn)、爬桿實(shí)驗(yàn)和懸掛實(shí)驗(yàn)等測(cè)試其行為學(xué)變化，取材后檢測(cè)血漿前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)變化，目的在于建立穩(wěn)定合理可重復(fù)的膿毒血癥相關(guān)腦病小鼠動(dòng)物模型，闡明CLP術(shù)后小鼠的學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能障礙。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，體重18～22 g，8～10周齡，均購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào): SYXK(粵)2012-0117，粵監(jiān)證字: SCXK (粵) 2013-0002。根據(jù)動(dòng)物護(hù)理指南將小鼠飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由進(jìn)食進(jìn)水，使用滅菌飼料和墊料，室溫維持在(22±2) ℃，12/12 h明暗周期，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境10 d 后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

2 主要試劑

PGE2ELISA試劑盒購(gòu)自R&D。

3 主要方法

3.1實(shí)驗(yàn)分組 第1部分實(shí)驗(yàn)將小鼠隨機(jī)分為4組：(1)正常對(duì)照(control)組(n=6)；(2)假手術(shù)(sham)組(n=6)：只對(duì)小鼠進(jìn)行盲腸分離，不行結(jié)扎穿孔術(shù)；(3)CLP1組(n=10)：用7號(hào)針對(duì)小鼠采取盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)；(4)CLP2組(n=10)：用12號(hào)針對(duì)小鼠采取盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)。第2部分實(shí)驗(yàn)將小鼠隨機(jī)分為3組：(1)正常對(duì)照組(n=9)；(2)假手術(shù)組(n=9)：只對(duì)小鼠進(jìn)行盲腸分離，不行結(jié)扎穿孔術(shù)；(3)CLP組(n=20)：用12號(hào)針對(duì)小鼠采取盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)；

3.2盲腸結(jié)扎穿孔術(shù) 小鼠禁食4 h后，用1.25%三溴乙醇按13 mL/kg劑量對(duì)其行腹腔注射麻醉。麻醉后將小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮后消毒腹部手術(shù)區(qū)域。在劍突下1～1.5 cm處沿腹白線做一約1 cm長(zhǎng)的豎切口，無(wú)菌條件下游離腸系膜和盲腸。在距盲腸末端約0.8 cm處用1號(hào)線結(jié)扎腸管，根據(jù)分組不同分別用7號(hào)和12號(hào)針穿孔2次，擠出少許糞便，擦干，回納盲腸。4號(hào)線縫合腹部肌肉和皮膚后，于小鼠頸部皮下注射生理鹽水(30 mL/kg)作為術(shù)后補(bǔ)液。假手術(shù)組小鼠，僅游離暴露盲腸，既不結(jié)扎也不穿孔。

3.3基本情況觀察及生存分析 CLP術(shù)后，連續(xù)7 d觀察記錄各組小鼠基本情況和存活數(shù)量。計(jì)算存活率，繪制生存曲線。

3.4神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分主要是用于評(píng)估小鼠的神經(jīng)行為變化[10]，包括角膜反射，耳廓反射，翻正反射，甩尾反射和逃避反射。角膜反射：用棉簽輕觸小鼠的角膜，引起眨眼或搖頭。耳廓反射：觸動(dòng)小鼠的耳廓引起強(qiáng)烈的頭部旋轉(zhuǎn)為正常。翻正反射：將小鼠標(biāo)置在仰臥位，迅速恢復(fù)俯臥位，并前后腳放平為正常。甩尾反射逃：短暫刺激尾巴，鼠轉(zhuǎn)身逃脫傷害為正常。逃避反射：給予小鼠身體短暫刺激，小鼠逃避刺激為正常。正常反射(1 s內(nèi))記為2分，反射遲鈍(1～10 s內(nèi))記為1分，無(wú)反射記為0分。記錄小鼠每種反射所得分?jǐn)?shù)，每項(xiàng)分?jǐn)?shù)相加記為總分，10分為滿分。

3.5Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是用于評(píng)價(jià)小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)[11]，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。在CLP術(shù)之前，將所有實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行連續(xù)1周的水迷宮訓(xùn)練：將平臺(tái)置于某一隨機(jī)象限，訓(xùn)練小鼠找到水下隱藏平臺(tái)，每天隨機(jī)3個(gè)象限，每個(gè)象限60 s，若小鼠60 s內(nèi)未找到隱藏平臺(tái)，則引導(dǎo)小鼠至平臺(tái)上停留10 s。CLP術(shù)后小鼠進(jìn)行水迷宮測(cè)試，其中定位航行實(shí)驗(yàn)：輕輕地將小鼠面向池壁、尾部朝水池中央放入水中隨機(jī)4個(gè)象限，記錄小鼠找到隱藏平臺(tái)所需的時(shí)間，記為逃避潛伏期；若小鼠在60 s 內(nèi)未找到平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)者需引導(dǎo)其至平臺(tái)并停留10 s，并記其潛伏期為60 s?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：平臺(tái)所在象限為目標(biāo)象限，撤除水下平臺(tái)，從目標(biāo)象限的對(duì)角線象限將小鼠放入水中，記錄小鼠在60 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)所在位置的次數(shù)及在目標(biāo)象限內(nèi)停留的時(shí)間。

3.6爬桿實(shí)驗(yàn) 所用的桿長(zhǎng)60 cm，直徑1 cm，在桿周纏2層紗布。在實(shí)驗(yàn)之前，持續(xù)3 d訓(xùn)練小鼠爬桿行為[12]。將小鼠置于桿的頂端，小鼠會(huì)沿桿往下爬，記錄小鼠爬完桿長(zhǎng)上半部分所用時(shí)間、下半部分所用時(shí)間及全長(zhǎng)所用時(shí)間。3 s內(nèi)完成記3分、6 s內(nèi)完成記2分、超過(guò)6 s完成記1 分，將3次分?jǐn)?shù)相加記為總分。

3.7懸掛實(shí)驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)之前，持續(xù)3 d訓(xùn)練小鼠爬桿行為。引導(dǎo)小鼠由前爪懸掛在桿上，觀察小鼠前后爪均抓不住桿，記0分；前爪可以抓住，記1分；只有一只后爪可以抓住，記2分；兩只后爪均可以抓住，記3分[13]。

3.8避暗實(shí)驗(yàn) 避暗實(shí)驗(yàn)利用小鼠趨暗避明的習(xí)性，避暗裝置分為暗室和明室，中間有一門(mén)洞相連，暗室底部鋪有通電的銅柵，小鼠進(jìn)入暗室即受到電擊。實(shí)驗(yàn)前3 d對(duì)小鼠進(jìn)行適應(yīng)訓(xùn)練，將小鼠頭朝室壁放入明室內(nèi)，不通電狀態(tài)下將明暗室之間的門(mén)洞敞開(kāi)，讓小鼠在兩室內(nèi)自由活動(dòng)5 min后取出。實(shí)驗(yàn)前2 d對(duì)小鼠進(jìn)行避暗訓(xùn)練，將小鼠頭朝室壁放入明室，關(guān)閉兩室之間門(mén)洞，通電后將門(mén)洞打開(kāi)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)5 min，電壓為36 V。記錄過(guò)程中小鼠首次進(jìn)入暗室的時(shí)間為逃避潛伏期，以及小鼠在5 min內(nèi)進(jìn)入暗室的次數(shù)為錯(cuò)誤次數(shù)。若小鼠5 min內(nèi)未進(jìn)入暗室，逃避潛伏期記為300 s，錯(cuò)誤次數(shù)記為0。

3.9ELISA CLP術(shù)后7 d，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過(guò)眼球采血法將各小鼠血液分別收集到1.5 mL的EP管中，室溫放置2 h后，1 000 ×g離心20 min。取上清液，即為血清。用R&D的PGE2ELISA試劑盒，根據(jù)試劑盒說(shuō)明測(cè)定小鼠血清中PGE2含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。用Kaplan-Meier分析存活率。組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CLP術(shù)后各組小鼠基本情況及存活率

CLP術(shù)后，小鼠出現(xiàn)嗜睡、豎毛、寒顫、抽搐和厭食等一系列癥狀，第1部分實(shí)驗(yàn)中7號(hào)針穿孔組小鼠48 h死亡率為20%，12號(hào)針穿孔組小鼠48 h死亡率為30%，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The survival analysis of mice in different group.

圖1 各組小鼠生存率分析

2 CLP術(shù)后小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分變化

第1部分實(shí)驗(yàn)中2組CLP小鼠術(shù)后3 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均開(kāi)始下降，至24 h下降最為顯著(P<0.01)，此后評(píng)分開(kāi)始恢復(fù)，但仍低于對(duì)照組和假手術(shù)組，見(jiàn)圖2。第2部分實(shí)驗(yàn)中CLP組小鼠24 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果統(tǒng)計(jì)與第1部分結(jié)果相一致，見(jiàn)表1。

Figure 2.Neurobehavioral scores of the mice in different group at different time. Mean±SEM.**P<0.01vscontrol group.

圖2 CLP術(shù)后小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分變化

表1 CLP術(shù)后24 h各組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

Table 1.Neurobehavioral scores of the mice in different group at 24 h after CLP (Mean±SEM)

GroupnNeurobehavioral scoresControl910±0Sham910±0CLP20 7.20±0.17**

**P<0.01vscontrol group.

3 CLP對(duì)小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

在第1部分水迷宮實(shí)驗(yàn)中，與正常組和假手術(shù)相比較，CLP1組與CLP2組小鼠術(shù)后尋找水下隱藏平臺(tái)的時(shí)間均顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，有的甚至在60 s結(jié)束之后仍無(wú)法成功尋找到平臺(tái)，見(jiàn)圖3。

在第2部分空間探索實(shí)驗(yàn)中，CLP組小鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間減少，60 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)也顯著少于對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.01)，見(jiàn)表2。

4 CLP對(duì)小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)的影響

第2部分爬桿實(shí)驗(yàn)中，采用12號(hào)針行CLP術(shù)，造成小鼠無(wú)法順利流暢地爬完全程，爬桿實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)的現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)跌落情況，見(jiàn)表3。

Figure 3.The results of navigation test in Morris Water Maze after CLP. Mean±SEM.**P<0.01vscontrol group.

圖3 CLP對(duì)小鼠水迷宮逃避潛伏期的影響

表2 CLP對(duì)小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的影響

Table 2.Spatial probe test for retention of crossing target plat- form and stay time after CLP (Mean±SEM)

GroupnStay time (s)Through platform numberControl932.29±3.788.00±1.21Sham931.11±2.207.71±0.42CLP2017.18±2.93**6.50±1.62**

**P<0.01vscontrol group.

表3 CLP對(duì)小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)的影響

Table 3.Pole test scores of the mice in different groups (Mean±SEM)

GroupnPole test scoresControl96.38±0.38Sham96.33±1.00CLP20 4.55±0.51**

**P<0.01vscontrol group.

5 CLP對(duì)小鼠懸掛實(shí)驗(yàn)的影響

第2部分懸掛實(shí)驗(yàn)中，正常組和假手術(shù)組小鼠能懸掛較長(zhǎng)時(shí)間，而CLP組小鼠在術(shù)后運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性受到顯著影響，雙后肢無(wú)法懸掛，或者僅前肢可短暫懸掛，或直接跌落，懸掛實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 CLP對(duì)小鼠懸掛實(shí)驗(yàn)的影響

Table 4.Wire suspension scores of the mice in different groups (Mean±SEM)

GroupnSuspension scoresControl93.00±0.00Sham93.00±0.00CLP20 1.64±0.33**

**P<0.01vscontrol group.

6 CLP對(duì)小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響

第2部分避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，CLP組小鼠在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后大部分活動(dòng)量顯著減小甚至無(wú)活動(dòng)，有的甚至未曾進(jìn)入暗室。在避暗實(shí)驗(yàn)中CLP術(shù)后的小鼠逃避潛伏期顯著高于對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.05)，錯(cuò)誤次數(shù)也顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Effects of CLP on the memory and learning of the mice in passive avoidance test．Mean±SEM.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4 CLP對(duì)小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響

7 CLP術(shù)后各組小鼠血清PGE2檢測(cè)結(jié)果

第2部分實(shí)驗(yàn)中，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取小鼠血清檢測(cè)PGE2改變。ELISA結(jié)果顯示，CLP術(shù)后小鼠血清中PGE2釋放量較正常組和假手術(shù)組顯著增多(P<0.01)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖5。

Figure 5.CLP promoted the release of PGE2in the serum of mice. Mean±SEM.**P<0.01vscontrol group.

圖5 CLP術(shù)后各組小鼠血清PGE2含量

討 論

動(dòng)物疾病模型的成功建立是為研究人類(lèi)疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，以及為研究人類(lèi)疾病的預(yù)防、治療、藥物篩選等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前建立膿毒癥動(dòng)物模型的方法主要有：盲腸結(jié)扎穿孔、經(jīng)腹腔或靜脈注射大劑量脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、腹腔持續(xù)置管引流、活細(xì)菌或病毒造成細(xì)菌性腹膜炎、軟組織感染等[14]。目前膿毒癥及其并發(fā)癥的動(dòng)物模型有很多，但是尚缺乏用于SAE及其預(yù)后長(zhǎng)期認(rèn)知功能障礙研究的穩(wěn)定小鼠模型。 CLP是建立膿毒癥模型的金標(biāo)準(zhǔn)，可重復(fù)性好，易于標(biāo)準(zhǔn)化，CLP術(shù)后的動(dòng)物通常很快表現(xiàn)出膿毒癥的癥狀和變化[15]。本實(shí)驗(yàn)采用CLP術(shù)建立穩(wěn)定的膿毒血癥小鼠模型，同時(shí)建立認(rèn)知功能障礙評(píng)價(jià)體系，為SAE研究奠定了模型基礎(chǔ)。

SAE是膿毒癥患者常見(jiàn)并發(fā)癥之一，發(fā)病率和病死率高，可出現(xiàn)在膿毒癥進(jìn)程的各個(gè)階段中[16]。在臨床中，由于SAE診斷標(biāo)準(zhǔn)尚未明確、診斷標(biāo)準(zhǔn)不一，缺乏特異性的檢測(cè)標(biāo)志物[17]，不同學(xué)者的研究對(duì)SAE發(fā)病率報(bào)道有較大差別，可在9%～71%不等，而由于患者常用的鎮(zhèn)靜劑、呼吸機(jī)、本身存在的神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性病變及伴隨的其它臟器衰竭、代謝紊亂等眾多復(fù)雜因素的存在，實(shí)際SAE的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)文獻(xiàn)中所報(bào)道的數(shù)據(jù)。在小鼠模型中SAE的發(fā)病率控制有一定難度，較大樣本量就可能會(huì)更好地控制SAE發(fā)病率的穩(wěn)定性。臨床上對(duì)SAE的診斷是一種排它性診斷，利用動(dòng)物模型研究SAE發(fā)病機(jī)制及治療方案，可通過(guò)觀察動(dòng)物的學(xué)習(xí)認(rèn)知功能改變進(jìn)行評(píng)價(jià)。

相關(guān)臨床研究數(shù)據(jù)表明，SAE的死亡率約在33%～39%之間[18]。實(shí)驗(yàn)證明，在CLP膿毒癥小鼠模型中，當(dāng)盲腸結(jié)扎長(zhǎng)度和穿刺次數(shù)一定的條件下，穿孔針的尺寸大小不同，小鼠死亡率和預(yù)后情況也并不一樣[9]。本次實(shí)驗(yàn)我們分別用7號(hào)針和12號(hào)針穿孔2次，引發(fā)小鼠膿毒癥相關(guān)腦病，旨在建立適合SAE預(yù)后長(zhǎng)期認(rèn)知功能障礙研究的穩(wěn)定的小鼠模型。7號(hào)針和12號(hào)針穿孔組小鼠48 h死亡率分別為為20%和30%，其中12號(hào)針穿孔組小鼠死亡率更符合SAE相關(guān)報(bào)導(dǎo)，且可成功復(fù)制該死亡率。

CLP術(shù)后，小鼠出現(xiàn)嗜睡、豎毛、寒顫、抽搐和厭食等一系列癥狀[19]，符合膿毒癥的癥狀，術(shù)后傷口愈合狀況良好。臨床上可觀察到SAE患者從輕微異常到深昏迷的意識(shí)狀態(tài)變化，患者輕者可表現(xiàn)為行為異常、意識(shí)狀態(tài)改變、注意力不集中等，嚴(yán)重病例可出現(xiàn)易激惹、譫妄、繼之昏迷[20-21]。本實(shí)驗(yàn)中CLP小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分始終低于正常組和假手術(shù)組，12號(hào)針組小鼠評(píng)分較7號(hào)針小鼠減少更為明顯，至24 h下降最明顯，此后得分開(kāi)始增高。

Morris 水迷宮[11]是應(yīng)用小鼠學(xué)習(xí)記憶能力來(lái)評(píng)價(jià)腦功能的經(jīng)典行為學(xué)方法[22]。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，我們首先動(dòng)態(tài)觀察了2種尺寸穿刺針CLP小鼠找到水下隱藏平臺(tái)的時(shí)間變化，在整個(gè)過(guò)程中較正常組和假手術(shù)組顯著延長(zhǎng)，12號(hào)針穿刺組小鼠的逃避潛伏期較7號(hào)針小鼠延長(zhǎng)更為顯著，且無(wú)改善趨勢(shì)。綜合死亡率、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分以及水迷宮動(dòng)態(tài)結(jié)果考慮，我們最終選取12號(hào)針作為CLP穿孔條件。

避暗實(shí)驗(yàn)是利用小鼠具有趨暗避明的習(xí)性設(shè)計(jì)，小鼠進(jìn)入暗室即受到電擊造成輕微不適，被迫逃回亮處并獲得記憶，對(duì)記憶過(guò)程特別是記憶再現(xiàn)有較高的敏感度。由于小鼠CLP術(shù)后精神恍惚異常、嗜睡、寒顫，CLP組小鼠實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后大部分保持剛進(jìn)入避暗裝置時(shí)的狀態(tài)蜷縮在明室內(nèi)活動(dòng)量顯著減小甚至無(wú)活動(dòng)，未曾進(jìn)入暗室，不存在記憶刺激和形成過(guò)程，由此可見(jiàn)避暗實(shí)驗(yàn)并不適用于SAE小鼠模型中學(xué)習(xí)認(rèn)知記憶功能的評(píng)價(jià)。

此外，CLP小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力也受到顯著影響[3]。爬桿實(shí)驗(yàn)是一種敏感的行為測(cè)試，可以反映運(yùn)動(dòng)功能障礙[12, 22]。在爬桿測(cè)試中，CLP組小鼠分?jǐn)?shù)降低，所需時(shí)間更長(zhǎng)，表明CLP術(shù)后小鼠運(yùn)動(dòng)能力顯著下降。懸掛實(shí)驗(yàn)，不僅可以檢測(cè)肌肉力量，還可檢測(cè)協(xié)調(diào)平衡能力[13]。我們的研究結(jié)果表明，CLP不僅會(huì)削弱小鼠肌肉力量，還會(huì)使其協(xié)調(diào)平衡能力受到損傷。

膿毒癥發(fā)生后，全身炎癥是機(jī)體對(duì)感染做出的主要的反應(yīng)，其進(jìn)展可能加速中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的器官功能障礙[23]，PGE2是炎癥、發(fā)熱及疼痛發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵介質(zhì)[24]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，膿毒癥病人血漿中PGE2的含量顯著增高，全身炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)免疫細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞受刺激后大量分泌PGE2[25]。本實(shí)驗(yàn)中CLP小鼠術(shù)后血清中PGE2釋放量顯著高于對(duì)照組和假手術(shù)組。

綜上所述，通過(guò)CLP術(shù)距盲腸末端0.8 cm處結(jié)扎盲腸后用12號(hào)針穿孔2次，可以成功構(gòu)建SAE小鼠模型，用此法建立的SAE小鼠模型存在學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能障礙，死亡率和行為學(xué)改變符合SAE臨床表現(xiàn)。