miR-509靶向Rac1調(diào)節(jié)人肝癌LM3細(xì)胞侵襲和遷移及裸鼠模型的存活*

王春玲，張榮芳，陳峰杰，周 露，姬穎華

(河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院1護(hù)理系，2教務(wù)處，3藥理學(xué)教研室，4基礎(chǔ)護(hù)理教研室，河南 安陽 455000；5新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 453100)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，亞洲和非洲是肝癌的高發(fā)區(qū)[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年，我國約有4 292 000例肝癌新發(fā)病例，2 814 000例肝癌死亡病例，并且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[3]。雖然近年來對于肝癌的診斷和治療水平有所提高，但肝癌患者的5年內(nèi)生存率依然很低[4]。高復(fù)發(fā)率是導(dǎo)致肝癌患者術(shù)后死亡的主要原因，并且腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制還不清楚[5-6]。因此，探究肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是尋找新的肝癌診斷及治療方法、增加肝癌患者生存時間及存活率的關(guān)鍵。大量研究表明，微小RNAs(microRNAs，miRNAs，miR)在細(xì)胞生長、增殖、凋亡和遷移過程中具有重要的調(diào)控作用，同時也可通過調(diào)控蛋白編碼基因的表達(dá)影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展[7-8]。研究表明，人體有超過60%的蛋白質(zhì)編碼基因上都具有miRNAs的結(jié)合位點(diǎn)[9]。miR-509是具有抑癌作用的miRNA，能夠抑制乳腺癌、卵巢癌和肺癌等多種腫瘤的轉(zhuǎn)移[10-12]。也有研究表明，miR-509高表達(dá)能抑制肝癌細(xì)胞生長[13]。但miR-509對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響還未見報(bào)道。本文以人肝癌細(xì)胞株LM3為研究對象，探究miR-509對肝癌的作用及作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 試劑與儀器

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、0.25%胰酶和胎牛血清均購自Gibco；miR-509模擬物(miR-509 mimic)和pcDNA Ras相關(guān)的C3肉毒毒素底物1(pcDNA Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, pcRac1)由上海吉瑪生物設(shè)計(jì)合成；Matrigel購自Invitriogen；抗Rac1抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠II抗購自Abcam(貨號分別為ab33186和ab6789); RIPA裂解液購自Sigma(貨號為R0278)；BCA試劑盒購自碧云天生物科技公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Thermo Fisher(貨號為11668500)；Dual-Luciferase?報(bào)告基因試劑盒購自Promega(貨號為E1910)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株LM3購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)LM3細(xì)胞。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。細(xì)胞融合率達(dá)到85%以上時用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞傳代培養(yǎng)于12孔板中，細(xì)胞密度為1×108/L。將細(xì)胞隨機(jī)分為LM3組、miR-509 mimic組、mimic+pcDNA組和mimic+pcRac1組。將細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染miR-509 mimic和pcRac1到LM3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染4 h后更換正常培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，48 h進(jìn)行相關(guān)檢測。

2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 用RIPA蛋白裂解液于冰上提取各組細(xì)胞或組織蛋白，用BCA試劑盒檢測各組蛋白濃度并調(diào)平。每組取等量蛋白質(zhì)用12% SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白質(zhì)2 h，以1∶1 000的濃度加入抗Rac1抗體，4 ℃孵育過夜。第2天棄去 I 抗，用緩沖液清洗PVDF膜后，加入 II 抗，室溫封閉1 h后，滴加ECL于暗室曝光顯影。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，以GAPDH為內(nèi)參照。

2.4螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 通過生物信息預(yù)測Rac1在miR-509序列上的結(jié)合片段，用RT-PCR擴(kuò)增此結(jié)合片段，將該片段插入到pMIR-Report螢光素酶載體中，構(gòu)建Rac1野生質(zhì)粒；利用基因位點(diǎn)突變技術(shù)將結(jié)合片段中部分核苷酸突變，構(gòu)建Rac1突變質(zhì)粒。用Rac1野生質(zhì)粒或突變質(zhì)粒與miR-509 mimic對LM3細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，根據(jù)Dual-Luciferase?報(bào)告基因試劑盒說明書檢測各組螢光素酶活性。

2.5Transwell實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞傳代接種于提前用Matrigel包被的Transwell小室上層，細(xì)胞密度為4×108/L，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，Transwell小室下層則加入正常細(xì)胞培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)48 h后用無菌棉簽拭去小室上層細(xì)胞，用結(jié)晶紫將遷移至小室下層的LM3細(xì)胞染色，每組隨機(jī)選取5個視野對染色細(xì)胞進(jìn)行基數(shù)統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，每組6個復(fù)孔。

2.6劃痕實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前1 d用標(biāo)記筆于12孔板背面畫出5條平行直線，消毒滅菌后備用。將LM3細(xì)胞以1×109/L的密度傳代培養(yǎng)于提前準(zhǔn)備好的12孔板中，用miR-509 mimic和pc Rac1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用10 μL槍頭垂直于培養(yǎng)板背面的橫線劃痕，用PBS清洗3次后，用無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨機(jī)選取5個視野，檢測肝癌細(xì)胞遷移情況。

2.7肝癌裸鼠移植瘤(patient-derived xenograft,PDX)模型的建立 60只SPF級4周齡雄性BALB/c裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物公司，許可證號為SCXK (京) 2014-0001。將裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)miR-509的LM3細(xì)胞。將裸小鼠隨機(jī)分為LM3組和miR-509 mimic組。收集細(xì)胞并將細(xì)胞密度調(diào)整至5×109/L，于miR-509組小鼠右前部背部皮下注射穩(wěn)定表達(dá)miR-509的LM3細(xì)胞懸液，LM3組小鼠于相同位置注射未轉(zhuǎn)染的LM3細(xì)胞。連續(xù)飼養(yǎng)30 d，每天記錄小鼠存活情況，計(jì)算小鼠存活率,存活率(%)=存活小鼠數(shù)/每組小鼠總數(shù)×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD) 表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-509對肝癌細(xì)胞Rac1表達(dá)的影響

與LM3組比較，miR-509 mimic組和mimic+pcDNA組LM3細(xì)胞Rac1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與mimic+pcDNA組比較，mimic+pcRac1組細(xì)胞的Rac1 表達(dá)水平顯著升高 (P<0.05)，見圖1，提示miR-509可能可靶向調(diào)控Rac1的表達(dá)。

Figure 1.The effect of miR-509 on the expression of Rac1 in LM3 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLM3 group;#P<0.05vsmimic+pcDNA group.

圖1 miR-509對肝癌細(xì)胞Rac1蛋白表達(dá)的影響

2 miR-509與Rac1的靶向關(guān)系

生物信息預(yù)測結(jié)果表明，miR-509序列上存在Rac1的連續(xù)結(jié)合序列。螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-509 mimic能顯著減弱Rac1野生質(zhì)粒的螢光素酶活性(P<0.05)；結(jié)合位點(diǎn)突變后，miR-509 mimic對Rac1突變質(zhì)粒螢光素酶活性的調(diào)控作用消失，見圖2，表明miR-509可靶向結(jié)合Rac1。

Figure 2.The relationship between miR-509 and Rac1 determined by luciferase reporter assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsRac1 WT group.

圖2 miR-509與Rac1的靶向關(guān)系

3 miR-509對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與LM3組比較，miR-509 mimic組和mimic+pcDNA組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)； 與mimic+pcDNA組比較，mimic+pcRac1組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05),見圖3，表明miR-509可通過抑制Rac1表達(dá)降低肝癌細(xì)胞侵襲能力。

4 miR-509對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響

與LM3組比較，miR-509 mimic組和mimic+pcDNA組肝癌細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低(P<0.05)；用miR-509 mimic和pcRac1同時轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞劃痕愈合率顯著升高，與mimic+pcDNA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

5 miR-509對肝癌模型小鼠存活率及對腫瘤組織Rac1表達(dá)的影響

與LM3組比較，miR-509 mimic組裸鼠存活率明顯升高(P<0.05),見圖5，表明miR-509 mimic能促進(jìn)肝癌模型小鼠存活。同時，miR-509 mimic還能顯著降低腫瘤組織Rac1的表達(dá)水平(P<0.01)，見圖6，表明miR-509可能通過抑制Rac1表達(dá)促進(jìn)肝癌模型小鼠存活。

Figure 3.The effect of miR-509 on the invasion ability of LM3 cells determined by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLM3 group;#P<0.05vsmimic+pcDNA group.

圖3 miR-509對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Figure 4.The effect of miR-509 on the migration of LM3 cells determined by wound healing assay (×100). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLM3 group;#P<0.05vsmimic+pcDNA group.

圖4 miR-509對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響

Figure 5.The effect of miR-509 on the survival of hepatocellular carcinoma model mice. Mean±SD.n=15.*P<0.05vsLM3 group.

圖5 miR-509對肝癌模型小鼠存活率的影響

Figure 6.The effect of miR-509 on the expression of Rac1 in tumor tissue of hepatocellular carcinoma measured by Western blot. GAPDH was used as loading control. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsLM3 group.

圖6 miR-509對肝癌腫瘤組織Rac1表達(dá)的影響

討 論

大量研究表明，miRNAs在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞生長、分化及遷移等[14]。miRNAs在多類腫瘤中的異常表達(dá)表明miRNAs可能與腫瘤的發(fā)生也密切相關(guān)。如microRNA-204和microRNA-30c-2-3p在乳腺癌中表達(dá)異常降低[15-16]；microRNA-301a和microRNA-484在乳腺癌中表達(dá)升高[17]；microRNA-192和microRNA-506等在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)水平低于正常結(jié)腸細(xì)胞[18-19]。miR-509等在肝癌細(xì)胞中也呈低表達(dá)狀態(tài)，但關(guān)于miR-509對肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力的作用及作用機(jī)制還未見報(bào)道[13]。Chen等[20]的研究表明，miR-509-3p可通過靶向調(diào)控凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用。miR-509還可通過調(diào)控PODXL抑制胃癌細(xì)胞侵襲和遷移[21]。本文采用miR-509 mimic提高miR-509在肝癌細(xì)胞LM3中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，miR-509 mimic能抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移，同時還能促進(jìn)肝癌皮下移植瘤模型小鼠的存活，表明miR-509在肝癌中發(fā)揮著抑癌的作用。

此外，miR-509 mimic能顯著降低肝癌細(xì)胞中Rac1的蛋白表達(dá)水平，pcRac1能減弱miR-509 mimic對Rac1表達(dá)的抑制作用，提示miR-509可能可靶向抑制肝癌細(xì)胞LM3 Rac1的表達(dá)。通過生物信息預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-509基因序列上存在Rac1的靶向結(jié)合位點(diǎn)，螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步表明miR-509可靶向結(jié)合Rac1。

Rac1是調(diào)控細(xì)胞骨架重組的關(guān)鍵調(diào)控分子，在細(xì)胞運(yùn)動過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[22]。研究表明，Rac1的表達(dá)水平和活性在多類腫瘤中均明顯升高，能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[23]。研究發(fā)現(xiàn)，Rac1與肺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，抑制Rac1活性可抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[24-25]。已有研究表明miR-509-3p可通過靶向調(diào)控Rac1表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞增殖[26]。長鏈非編碼RNA可通過抑制miR-509表達(dá)上調(diào)Rac1活性，從而促進(jìn)骨肉瘤癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[27]。本文研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Rac1的表達(dá)能顯著減弱miR-509 mimic對肝癌細(xì)胞侵襲的抑制作用，表明miR-509抑制肝癌細(xì)胞侵襲的作用與下調(diào)Rac1表達(dá)有關(guān)。此外，pcRac1能明顯減弱miR-509 mimic對肝癌細(xì)胞遷移的抑制作用，進(jìn)一步表明miR-509可通過靶向抑制肝癌LM3細(xì)胞Rac1的表達(dá)抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-509能抑制肝癌細(xì)胞Rac1表達(dá)，并能抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移，上調(diào)Rac1表達(dá)能明顯減弱miR-509對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用。本文對miR-509對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用和作用機(jī)制進(jìn)行探討，可能為臨床尋找治療肝癌及減緩肝癌發(fā)展的方法提供了新的思路。