黏蟲溶菌酶基因Mswly的克隆與真核表達(dá)

張元臣，蔡 新，張國強(qiáng)，董麗麗，王景順

(安陽工學(xué)院，河南 安陽 455000)

黏蟲(Mythimnaseparata)屬鱗翅目夜蛾科(Lepidoptera:Noctuidae)，是一種雜食性、遷飛性昆蟲[1]。其能危害玉米、小麥、水稻等16科300多種農(nóng)作物，給我國糧食作物生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅[1-2]。黏蟲危害具有群聚性、突發(fā)性和暴食性的特點，大發(fā)生時短時間內(nèi)即可將作物葉片全部吃光，造成作物嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕收[3]。僅僅2012年，黏蟲在華北、東北的成災(zāi)面積近467萬hm2，直接經(jīng)濟(jì)損失超過20億元[4]。當(dāng)前對黏蟲防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，但是化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境污染嚴(yán)重、對人畜有害，同時抗藥性也經(jīng)常出現(xiàn)[5]，亟待安全、綠色和高效的黏蟲防治方法。

蟲生真菌具有藥效持效期長、無污染、不傷害天敵等特點，受到了越來越多的關(guān)注[6-7]。蟲生真菌可以通過獨特的侵染方式到達(dá)寄主體壁侵入害蟲，從而導(dǎo)致害蟲死亡[8]。目前商品化的蟲生真菌主要有白僵菌(Beauveriabassiana)和綠僵菌(Metarhiziumanisopliaevar)[9]。國內(nèi)外已經(jīng)利用白僵菌和綠僵菌防治玉米螟(Pyraustanubilalis)、赤松毛蟲(Dendrolimusspectabilis)、金龜子和蚊子等害蟲，并取得非常顯著的效果，得到了廣泛的認(rèn)可[10-12]。然而，蟲生真菌對一些害蟲及高齡期害蟲的防治效果并不理想[13-14]。這很可能與這些昆蟲自身能夠抵御病原真菌的入侵有關(guān)。昆蟲的免疫系統(tǒng)依靠抗菌肽和免疫因子能清除侵入的蟲生真菌[8,15-16]。其中，免疫因子溶菌酶(Lysozyme)很可能在抵御病原真菌的入侵方面起著重要作用，從而抑制蟲生真菌的防治效果。對甜菜夜蛾(Spodopteraexigua) 和斜紋夜蛾(S.litura)注射綠僵菌24 h后，溶菌酶基因的表達(dá)水平急劇增高[17]，而東亞飛蝗(Locustamigratoria)被綠僵菌侵染后有2個溶菌酶基因下調(diào)表達(dá)，1個溶菌酶基因上調(diào)表達(dá)[18]。紅棕象甲(Rhynchophorusferrugineus)受到綠僵菌和白僵菌侵染后，溶菌酶基因的表達(dá)量也出現(xiàn)了顯著的上調(diào)[19]。白僵菌侵染后，埃及伊蚊(Aedesaegypti)和草地螟(Loxostegesticticalis)溶菌酶基因表達(dá)水平分別在脂肪體和血淋巴中顯著提升[20-21]。提升環(huán)境溫度后，大蠟螟(Galleriamellonella)溶菌酶活性升高，從而使大蠟螟受白僵菌脅迫時存活率明顯升高[22-23]。體外表達(dá)的C型溶菌酶蛋白對真菌有明顯的抑制作用。例如，重組的大蠟螟C型溶菌酶蛋白能顯著抑制白色念珠菌(Candidaalbicans)的生長[24]。這些研究均表明,溶菌酶在昆蟲防御蟲生真菌的入侵過程中起著重要作用。

根據(jù)結(jié)構(gòu)特點，昆蟲溶菌酶分為C型(Chicken-type)和I型(Invertebrate-type)2種，但是參與昆蟲免疫反應(yīng)的主要是C型溶菌酶[25]。研究表明，不同昆蟲的C型溶菌酶抗菌圖譜明顯不同[26-27]，然而目前尚未見有關(guān)黏蟲C型溶菌酶基因的研究報道。為此，對黏蟲脂肪體溶菌酶基因Mswly展開研究，首先從黏蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝結(jié)果中分析篩選與已知鱗翅目中腸溶菌酶基因同源的部分cDNA序列，然后利用RT-PCR和RACE技術(shù)獲得黏蟲Mswly的全長序列，同時進(jìn)行體外真核表達(dá)，以期為進(jìn)一步研究該基因抑制蟲生真菌的機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

黏蟲在溫度25 ℃、光照周期14∶10(L∶D)的人工氣候箱內(nèi)，用人工飼料長期進(jìn)行飼養(yǎng)，人工飼料參考路子云等[28]的方法配制。草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞系Sf9細(xì)胞在 27 ℃恒溫箱培養(yǎng)。桿狀病毒表達(dá)載體pFast Bac1(Invitrogen 公司)由安陽工學(xué)院生物工程實驗室保存。培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)基SF-900 Ⅲ SFM與胎牛血清(Fetal bovine serum)均購自美國Gibco公司。

克隆載體pEASY-T3，大腸桿菌DH5α、DH10Bac感受態(tài)和蛋白質(zhì)上樣Buffer購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶(EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ)、T4 DNA連接酶、Trizol、DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RACE試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。引物合成和基因測序在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 黏蟲Mswly基因部分片段的克隆

將五齡黏蟲幼蟲解剖，脂肪體收集于含有250 μL Trizol且無RNA酶的1.5 mL EP管中，按照Trizol提取法提取RNA。以1 000 ng的總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，放置于-20 ℃?zhèn)溆?。用棉鈴蟲溶菌酶基因序列通過Blastn從黏蟲轉(zhuǎn)錄組中比對出黏蟲溶菌酶的類似序列，用Primer 5設(shè)計引物Mswly-1F和Mswly-1R(表1)。以黏蟲脂肪體總RNA合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系50 μL，其中上、下游引物各1.2 μL，PCR Master mix 25.0 μL，cDNA模板6.0 μL，ddH2O 16.6 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，之后擴(kuò)增35個循環(huán)(95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s)，最后延伸5 min，在10 ℃條件下保存。PCR產(chǎn)物用1.4%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，回收目的產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接克隆載體pEASY-T3，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，陽性克隆質(zhì)粒通過雙酶切驗證后，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

表1 研究所用的引物及其用途Tab.1 Primers and their use in the experiment

1.3 黏蟲Mswly基因末端快速克隆

根據(jù)1.2中克隆到的Mswly序列設(shè)計5′和3′端Inner引物和Outer引物，引物序列見表1。以黏蟲脂肪體總RNA為模板，按照寶生物RACE試劑盒說明書合成5′和3′RACE模板。按照試劑盒要求的PCR擴(kuò)增體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后用1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，回收目的條帶，進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選和陽性克隆的測序，方法與1.2相同。

1.4 黏蟲Mswly基因全長序列的拼接與驗證

將5′端cDNA序列、3′端cDNA序列和Mswly片段序列進(jìn)行拼接，獲得全長序列。為了進(jìn)一步驗證Mswly全長序列，從起始密碼子前端設(shè)計上游引物Mswly-2F，從終止密碼子后端設(shè)計下游引物Mswly-2R(表1)。以黏蟲脂肪體的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的檢測、目的條帶的克隆、測序與1.2相同。

1.5 黏蟲Mswly基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

將Mswly基因全長cDNA序列送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化，合成Mswly基因堿基全長序列，并在下游末端添加His標(biāo)簽序列。將合成帶有標(biāo)簽的全長序列連接到克隆載體pEASY-T3上，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，鑒定出陽性克隆，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。以此陽性質(zhì)粒為模板，用Mswly-3R和Mswly-3F(表1)作引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將目的片段連接到克隆載體pEASY-T3上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，鑒定并提取陽性克隆質(zhì)粒(pMswly)。用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ分別對重組質(zhì)粒pMswly和表達(dá)載體pFast Bac1進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系參照說明書。之后用1.4%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，回收目的產(chǎn)物。取以上2種載體雙酶切回收的產(chǎn)物各4 μL,與1 μL T4 DNA 連接酶和1 μL 10×T4 Ligase Buffer混合后，在16 ℃條件下過夜進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。陽性克隆質(zhì)粒(pF-Mswly)經(jīng)PCR和雙酶切檢測后，一部分在-20 ℃保存?zhèn)溆?，一部分送往生工生物工?上海)股份有限公司進(jìn)行測序驗證。

1.6 重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒pBacmid-Mswly的制備

根據(jù)說明書，取5 μL pF-Mswly轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，之后用LB固體培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan、10 μg/mL Tet、7 μg/mL Gen、10 μg/mL Bluo-Gal、40 μg/mL IPTG)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑選白色單菌落在含有 Kan(50 μg/mL)、Gen(7 μg/mL)和 Tet(10 μg/mL)的LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取重組 DNA，獲得重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒pBacmid-Mswly。

1.7 重組質(zhì)粒pBacmid-Mswly轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞及重組蛋白的表達(dá)檢測

用pBacmid-Mswly轉(zhuǎn)染處于對數(shù)期、長勢良好的Sf9 昆蟲細(xì)胞。27 ℃培養(yǎng)，至細(xì)胞有明顯的被病毒侵染癥狀時，收集細(xì)胞液，500 r/min 離心3～5 min，上清即為P1代重組桿狀病毒。參照Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作說明書，將P1代重組桿狀病毒在Sf9昆蟲細(xì)胞上連續(xù)擴(kuò)增至P3代，用 P4 代重組病毒侵染大量處于對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細(xì)胞，72 h后收集全細(xì)胞樣品。用PBS緩沖液(pH值8)洗滌昆蟲細(xì)胞后，加入2×SDS蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液，在開水中煮10 min，12 000 g離心10 min 后，吸取10 μL 進(jìn)行SDS-PAGE電泳。表達(dá)的目的蛋白末端含有His標(biāo)簽序列，用His標(biāo)簽單克隆抗體進(jìn)行Western blotting分析，檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用NCBI在線工具ORF Finder預(yù)測Mswly基因的完整閱讀框(ORF)；Mswly蛋白的等電點和分子質(zhì)量利用Protparam軟件進(jìn)行預(yù)測；用在線NetNGlyc 1.0 Server和NetPhos 2.0 Server軟件分別分析糖基化位點和磷酸化位點；利用SignalP 4.1 Server在線預(yù)測Mswly蛋白的信號肽；采用ClustalW 2和DNAMAN 7.0軟件制作不同物種間溶菌酶氨基酸序列的多重聯(lián)配圖；利用ClustalW 2和MEGA 6.0軟件采用鄰接法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mswly基因全長 cDNA 序列及結(jié)構(gòu)分析

通過特異性引物擴(kuò)增獲得Mswly基因部分cDNA序列323 bp(圖1)，之后設(shè)計引物進(jìn)行5′和3′RACE擴(kuò)增，5′端cDNA序列218 bp，3′端cDNA序列279 bp(圖1)。之后將這三部分cDNA序列進(jìn)行拼接，5′端有63 bp重復(fù)序列，3′端有105 bp重復(fù)序列，因此基因全長652 bp，將其命名為Mswly。ORF Finder在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)，ORF全長426 bp，共編碼141個氨基酸殘基，5′非編碼區(qū)85 bp，3′非編碼區(qū)141 bp(圖2)。之后，通過ORF全長序列的擴(kuò)增和測序也進(jìn)一步驗證了預(yù)測結(jié)果的正確性。

M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：Mswly片段PCR產(chǎn)物；3、4：5′RACE產(chǎn)物；5、6：3′RACE產(chǎn)物 M:DNA Marker；1,2：PCR product of partialMswlycDNA；3,4：PCR product ofMswlyby 5′RACE；5,6：PCR product ofMswlyby 3′RACE圖1 Mswly基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification product ofMswly

下劃線部分為預(yù)測的信號肽序列；實線方框代表預(yù)測的糖基化位點；虛線方框代表預(yù)測的磷酸化位點The underlined line represents the sequence of predicted signal peptide；The predicted glycosylation site is boxed in solid line；The predicted phosphorylation sites are boxed in dotted line圖2 Mswly基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences ofMswly

2.2 Mswly基因編碼蛋白的特性分析

利用在線Protparam 軟件預(yù)測，Mswly蛋白分子質(zhì)量為16.26 ku，理論等電點(pI)為6.57。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，第52位的天冬氨酸為Mswly僅有的糖基化位點，屬于N-糖基化位點(圖2)。還存在12個磷酸化位點，分別為 6個絲氨酸(Ser54,69,85,86,98,109)，5個蘇氨酸(Thr58,87,96,102,106)和 1 個絡(luò)氨酸(Tyr81)位點(圖 2)。利用在線 SignalP 4.1 Server軟件分析發(fā)現(xiàn)，Mswly蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，而存在信號肽，切口在第20個和21個氨基酸之間(圖2)。

2.3 Mswly蛋白序列比對與進(jìn)化分析

在NCBI利用Blastp進(jìn)行同源分析,結(jié)果表明，Mswly氨基酸序列與棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)、斜紋夜蛾、黃豆銀紋夜蛾(Chrysodeixisincludens)等昆蟲溶菌酶有非常高的同源性，分別為68%、63%、63%、61%。多重聯(lián)配結(jié)果表明，不同物種間有多個高度保守的氨基酸位點，而且Mswly具有溶菌酶活性所必需的谷氨酸和天冬氨酸位點，且其在不同物種間高度保守(圖3)。

黑色正方形代表的是溶菌酶活性所必需的谷氨酸和天冬氨酸活性位點。由深變淺3種覆蓋顏色分別代表氨基酸有100%、75%和50%的一致性。Haxy：異色瓢蟲；Tcas:赤擬谷盜；Agam：岡比亞按蚊；Dmel：黑腹果蠅；Hsap：智人；Omou：毛白鈍緣蜱；Ecab：家馬；Ggal：原雞The positions of the catalytic glutamic acid (E) and aspartic acid (D) residues essential for lysozyme activity are indicated by square symbols.Amino acids with 100%,75% and 50% identity are covered by three colors from dark to light,respectively．Haxy：Harmonia axyridis； Tcas:Tribolium castaneum； Agam：Anopheles gambiae；Dmel：Drosophila melanogaster；Hsap：Homo sapiens；Omou：Ornithodoros moubata； Ecab：Equus caballus；Ggal：Gallus gallus圖3 黏蟲Mswly與其他物種溶菌酶氨基酸序列的多重聯(lián)配Fig.3 Multiple amino acid sequence alignment ofM.separatalysozyme Mswly with selected lysozymes from other species

根據(jù)黏蟲和其他物種的溶菌酶氨基酸序列構(gòu)建了進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，Mswly與棉鈴蟲、家蠶(Bombyxmori)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、地中海實蠅(Ceratitiscapitata)等昆蟲的C型溶菌酶聚集在一起，與I型溶菌酶的距離近于G型溶菌酶(圖4)，說明克隆得到的黏蟲溶菌酶為C型溶菌酶。

采用鄰接法，自舉檢驗1 000次；標(biāo)尺為遺傳距離Neighbor joining method with 1 000 bootstrap replicates is applied.The scale bar represents the genetic distance圖4 黏蟲和其他物種溶菌酶氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of lysozymes ofM.separataand other species based on amino acid sequences

2.4 Mswly基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ分別對重組質(zhì)粒pMswly和表達(dá)載體pFast Bac1進(jìn)行雙酶切，將兩者回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選得到陽性表達(dá)質(zhì)粒。將此質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證，得到pFast Bac1載體條帶(4 775 bp)和含有His標(biāo)簽的Mswly基因全長條帶(465 bp) (圖5A)，同時以此質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，也得到Mswly基因全長條帶(426 bp)(圖5B)，這些結(jié)果表明已成功構(gòu)建帶有Mswly基因序列的重組桿狀病毒表達(dá)載體 pF-Mswly。

M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1、2:重組桿狀病毒質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物;3、4:重組桿狀病毒質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.5 Mswly蛋白的真核表達(dá)及檢測

用pBacmid-Mswly侵染Sf9細(xì)胞，表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)破碎法提取后，用SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行檢測。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，從pBacmid-Mswly質(zhì)粒侵染后的 Sf9細(xì)胞中提取獲得的非可溶蛋白在約 17 ku處有明顯的特異條帶 (圖6)。從 SDS-PAGE凝膠中切取位于約 17 ku處的條帶，采用蛋白質(zhì)譜進(jìn)行檢測，結(jié)果證實17 ku的蛋白質(zhì)條帶確實為Mswly蛋白，表明Mswly蛋白在Sf9細(xì)胞中成功表達(dá)。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：含有His標(biāo)簽的對照蛋白樣品；2、3：通過Sf9細(xì)胞系表達(dá)的Mswly蛋白

3 結(jié)論與討論

與脊椎動物不同，昆蟲缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，必須依賴于先天性免疫系統(tǒng)抵御病原微生物的入侵，其中溶菌酶是昆蟲先天免疫系統(tǒng)中抑制病原物的重要效應(yīng)分子[29-30]。對于沒有進(jìn)行基因組測序的昆蟲來說，采用RACE技術(shù)獲得基因全長是一種有效的手段[31]。本研究通過RT-PCR和RACE技術(shù)克隆得到了黏蟲溶菌酶基因序列，命名為Mswly，其全長652 bp，開放閱讀框426 bp，編碼141個氨基酸殘基，N端20個氨基酸殘基為信號肽序列。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究黏蟲C型溶菌酶的生理功能奠定了基礎(chǔ)。

目前，將自然界溶菌酶分為C型、I型、細(xì)菌型(Bacterial-type)、G型(Goose-type)、噬菌體型(Phage-type)和 植物型(Plant-type)等六大類[32]，但是在昆蟲中僅含有C型和I型溶菌酶[25]。根據(jù)進(jìn)化樹分析結(jié)果，黏蟲Mswly與其他物種的C型溶菌酶聚集為一類，說明Mswly編碼的蛋白質(zhì)屬于C型溶菌酶。在NCBI上通過Blastp進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，Mswly與其他物種的C型溶菌酶同源性較高，均在60%以上。不同昆蟲體內(nèi)有不同種類和數(shù)量的溶菌酶[33]，本研究僅僅獲得1個C型溶菌酶基因的序列，黏蟲體內(nèi)是否有多個溶菌酶基因，需要進(jìn)一步研究。

一些研究采用原核表達(dá)蛋白來確定昆蟲一些抗菌因子的抗菌活性，然而大部分蛋白質(zhì)表達(dá)后要進(jìn)行修飾才具有生理活性[34]。原核表達(dá)缺乏蛋白質(zhì)翻譯后修飾，從而使一些蛋白質(zhì)雖然得到了表達(dá)，但是活性往往不理想[35]。桿狀病毒昆蟲表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)Ρ磉_(dá)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾加工，而且安全性好、表達(dá)外源蛋白效率高，被選擇作為試驗的載體表達(dá)系統(tǒng)[36-37]。本研究構(gòu)建了含有Mswly基因的穿梭病毒質(zhì)粒并且在Sf9昆蟲細(xì)胞系中成功表達(dá)，大小約17 ku。昆蟲除了半翅目外，其他目都至少有1個C型溶菌酶具有溶菌活性[38-39]。通過多重聯(lián)配分析發(fā)現(xiàn)，獲得的黏蟲Mswly具有溶菌酶所必需的活性位點，推測其很有可能具有抗菌活性，這需要進(jìn)一步的試驗驗證。后續(xù)將大量純化Mswly蛋白，用于鑒定其對白僵菌和綠僵菌的抑菌活性，為進(jìn)一步探索農(nóng)業(yè)害蟲對蟲生真菌不敏感的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。