正交試驗(yàn)法優(yōu)選山黃祛痛噴霧劑醇提工藝

林新艷，王 宓，徐 超，殷書(shū)梅

（江蘇康緣陽(yáng)光藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210046）

山黃祛痛噴霧劑是由南京中醫(yī)藥大學(xué)汪悅教授有效驗(yàn)方篩選而成的中藥注冊(cè)六類新藥，由麗江山慈菇、鳳仙透骨草等4味中藥組方，具有清熱解毒、消腫止痛之功效，用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱蘊(yùn)毒證。方中君藥麗江山慈菇主要化學(xué)成分為秋水仙堿、角秋水仙堿、β-光秋水仙堿及N-甲酸-N-去乙酰秋水仙堿等多種生物堿［1］，其中有效成分秋水仙堿為小分子化合物，易溶于冷水、乙醇、氯仿等，在乙醚中極微溶解，在熱水中難溶，對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有選擇性抑制作用。鳳仙透骨草主要化學(xué)成分為東莨菪素、山柰酚-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、蹄紋天竺素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷及飛燕草素-3-葡萄糖苷等，主要為黃酮苷類成分，不溶或難溶于水，在乙醇中溶解性能較好［2-3］。本研究中通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)法，選擇秋水仙堿、槲皮素含量和出膏率為指標(biāo)，考察山黃祛痛噴霧劑醇提工藝條件，提高了有效成分轉(zhuǎn)移率，為產(chǎn)品的制備和進(jìn)一步研究提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀及DAD二極管陣列檢測(cè)器（安捷倫科技有限公司）；Mettler AB135-S型電子天平（十萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多公司）；SY2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SK8200HP型超聲波清洗機(jī)（上?？茘u自動(dòng)化系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試藥

麗江山慈菇Iphigenia indicaKunth和鳳仙透骨草Impatiens balsaminaL.均購(gòu)自亳州市譙港藥業(yè)有限公司，經(jīng)江蘇省食品藥品檢驗(yàn)研究院胡浩斌主任藥師鑒定為正品，符合法定要求［4-5］；秋水仙堿對(duì)照品（美國(guó)sigma公司，批號(hào)為2005985，純度為98.0%）；槲皮素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111514-200403，純度為98.0%）；甲醇（色譜純，美國(guó)Merk公司，批號(hào)為20100825）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以乙醇作為提取溶劑，采用L9（34）正交試驗(yàn)法對(duì)乙醇濃度（因素 A）、乙醇用量（因素 B）、回流時(shí)間（因素 C）、回流次數(shù)（因素D）進(jìn)行2味藥材的回流提取工藝優(yōu)選，選取有效成分秋水仙堿、槲皮素含量和出膏率為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。因素水平見(jiàn)表1。

2.2 正交試驗(yàn)樣品制備

稱取麗江山慈菇9 g、鳳仙透骨草6 g，共9份，分別按正交試驗(yàn)表所列條件回流提取，合并提取液，回收乙醇，適量濃縮，分別定容至100 mL，備用。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表

2.3 秋水仙堿含量測(cè)定

2.3.1 麗江山慈菇藥材處理

取麗江山慈菇粉末0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，以70%甲醇25 mL水浴回流提取2次，每次2.0 h，放冷，濾過(guò)，濾液減壓回收至干，以甲醇定容至25 mL容量瓶中，以 0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3.2 溶液制備

取秋水仙堿對(duì)照品適量，精密稱定，用70%甲醇配制成質(zhì)量濃度為 0.018 9 g／L 的溶液，以 0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得對(duì)照品溶液。取醇提正交試驗(yàn)樣品溶液，精密移取1 mL置25 mL容量瓶中，以70%甲醇稀釋至刻度，離心，取上清液，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.3.3 色譜條件

色譜柱：Phenomenex luna C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -水（45 ∶55）；流速：1.0 mL ／min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4 槲皮素含量測(cè)定

2.4.1 鳳仙透骨草藥材處理

圖1 高效液相色譜圖

取鳳仙透骨草粉末1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液20 mL，精密加入25%鹽酸7 mL，置85℃水浴中水解30 min，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2 溶液制備

精密稱取槲皮素對(duì)照品適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為 0.006 22 g／L 的溶液，以 0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得對(duì)照品溶液。

取醇提正交試驗(yàn)樣品溶液，精密移取10 mL置蒸發(fā)皿中，蒸至近干，加入甲醇15 mL、25%鹽酸7 mL溶解殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至錐形瓶中，水浴回流30 min，濾過(guò)，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，以70%甲醇稀釋至刻度，離心，取上清液，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.4.3 色譜條件

色譜柱：Phenomenex luna C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -0.1% 磷酸溶液（40 ∶60）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.5 指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果

經(jīng)高效液相色譜法［6-7］測(cè)得麗江山慈菇藥材中秋水仙堿含量為4.09 mg／g，色譜圖見(jiàn)圖1。根據(jù)槲皮素理化特性槲皮素含量測(cè)定方法［8］，測(cè)得鳳仙透骨草藥材中槲皮素含量為0.189 mg／g，色譜圖見(jiàn)圖2。

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

9份樣品中測(cè)得的麗江山慈姑中秋水仙堿含量、鳳仙透骨草中槲皮素含量及出膏率結(jié)果見(jiàn)表2。按正交試驗(yàn)條件采用綜合評(píng)分法，對(duì)影響提取工藝的主要因素設(shè)定權(quán)重系數(shù)，秋水仙堿轉(zhuǎn)移率（Ya）為0.5，槲皮素轉(zhuǎn)移率（Yb）為 0.3，出膏率（Yc）為 0.2，進(jìn)行加權(quán)評(píng)分，公式為Y＝0.5Ya+0.3Yb+0.2Yc。方差分析結(jié)果見(jiàn)表 3。

圖2 高效液相色譜圖

表2 回流提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

由方差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)提取影響大小順序?yàn)镈＞A＞C＞B，最優(yōu)工藝水平為A2B3C2D2，即10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1.5 h?；亓魈崛〈螖?shù)為最顯著影響因素，乙醇用量為最小影響因素，而8倍量溶劑（K＝213.29）與 10倍量溶劑（K＝213.53）在提取效率上無(wú)顯著差異。從產(chǎn)業(yè)化節(jié)約能耗方面考慮，宜選擇8倍量溶劑進(jìn)行回流提取。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

取3份同批次麗江山慈菇與鳳仙透骨草藥材，按以上正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，每份樣品平行測(cè)定2次。結(jié)果3份樣品中秋水仙堿每1 g生藥平均含量分別為 3.61，3.60，3.64 mg；槲皮素每 1 g 生藥平均含量分別為 0.163，0.161，0.165 mg。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)選工藝條件在有效成分提取率和重復(fù)性上具有較好優(yōu)勢(shì)。

3 討論

山黃祛痛噴霧劑處方中君藥麗江山慈菇的主要成分為秋水仙堿，是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有效的首選抗炎劑，對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有選擇性抑制作用［9］，其作用機(jī)制在于秋水仙堿能和微管蛋白結(jié)合，妨礙有絲分裂中紡錘體的功能，并引起粒細(xì)胞和其他可移動(dòng)細(xì)胞中原纖維微管解聚和消失。這是秋水仙堿有效作用的基礎(chǔ)，即抑制粒細(xì)胞移向發(fā)炎區(qū)，減少粒細(xì)胞代謝和吞噬活動(dòng)［10］，減少了發(fā)生于吞噬作用的乳酸和引起炎癥的酶的前體釋放，打破炎性反應(yīng)的循環(huán)。其次，鳳仙透骨草中有效成分槲皮素的藥理活性甚廣，具有抗炎、抗過(guò)敏、正性肌力作用、降低毛細(xì)血管通透性、降低血清膽固醇等作用［11-13］，同時(shí)還有良好的鎮(zhèn)痛作用，顯著的特點(diǎn)是小劑量局部用藥速效、高效。

中藥是一個(gè)物質(zhì)群，其藥效作用更是物質(zhì)群的綜合作用。控制中藥的內(nèi)在質(zhì)量，即需要對(duì)中藥內(nèi)在化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行控制。目前，對(duì)山黃祛痛噴霧劑復(fù)雜的物質(zhì)群及其與功效之間的相互關(guān)系了解有限，因此，只能選取有限的具有生物活性的多個(gè)指標(biāo)綜合考察山黃祛痛噴霧劑醇提工藝。麗江山慈菇和鳳仙透骨草在法定藥材標(biāo)準(zhǔn)中尚無(wú)含量檢測(cè)項(xiàng)，根據(jù)指標(biāo)成分秋水仙堿和槲皮素的理化特性，確定了乙醇濃度、乙醇用量、回流時(shí)間、回流次數(shù)4個(gè)影響因素，并采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行考察，最終得出回流提取最佳工藝為麗江山慈菇和鳳仙透骨草采用8倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1.5h。在此條件下，秋水仙堿和槲皮素成分提取率和出膏率最高，且提取方法穩(wěn)定、可靠，可為山黃祛痛噴霧劑后續(xù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供參考。