基于指紋圖譜及化學識別模式的烏梅炮制品質(zhì)量評價*

孫 全，徐 沖，劉 霞，郭小紅，李 杰，冷 靜

（重慶市中醫(yī)院藥劑科，重慶 400021）

烏梅為薔薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.Et Zucc的干燥近成熟果實，具有斂肺、澀腸、生津、安蛔之功效，藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，常用于肺虛久咳，久瀉久痢，虛熱消渴，蛔厥嘔吐、腹痛等［1］?！督饏T玉函經(jīng)》《備急千金要方》《外臺秘要》《普濟方》均提及烏梅炮制方法，有醋泡、醋蒸、醋煮等。2015年版《中國藥典（一部）》收載的烏梅及其飲片包括烏梅［2-3］、烏梅肉［4］、烏梅炭［5-6］。目前關(guān)于烏梅及不同炮制品指紋圖譜的比較研究少見報道。本研究中采用指紋圖譜相似度評價與化學識別模式相結(jié)合的方式［7-14］綜合分析烏梅不同炮制品的質(zhì)量，為其質(zhì)量控制和臨床應用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；XA205DU型天平（十萬分之一，梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司）；AS10200AT型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

烏梅（四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號為D1506073），經(jīng)重慶市中醫(yī)院藥劑科副主任中藥師陳玲鑒定為正品，符合2015年版《中國藥典（一部）》烏梅項下的規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品制備

取烏梅藥材100 g，加入米醋200 mL，浸泡12 h，干燥，得醋烏梅。取烏梅肉，預熱炒藥鍋至100℃時投入烏梅肉100 g，并待鍋溫升至235℃時開始計時，控制此溫度不變，共炒制8 min，迅速出鍋，熄滅火星，攤涼即得烏梅炭［15］。取烏梅藥材 100 g，加醋 45 mL，拌勻，分別隔水蒸2，3，4 h，干燥，得不同蒸制時間的醋蒸制烏梅樣品。

2.2 提取溶劑考察

采用不同的提取溶劑（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇）進行超聲處理，將提取液進行液相分析，30%甲醇提取液的色譜峰較多，故選擇30%甲醇作為烏梅各種炮制樣品的提取溶劑。

2.3 測定波長選擇

通過紫外全波長掃描，烏梅提取液在215，288，314 nm波長處有最大吸收，分別將215，288，314 nm作為檢測波長對烏梅進行分析，烏梅提取液在215 nm波長處的基線較平穩(wěn)，色譜峰較多，故選215 nm作為檢測波長。

2.4 供試品溶液制備

取烏梅不同炮制品樣品1 g，精密稱定，加入50 mL 30%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取1 h，用30%甲醇補足減失的質(zhì)量，提取液用0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.5 色譜條件

色譜柱：PhenomenexC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；檢測波長：215 nm；流速：0.6 mL ／min；柱溫：25 ℃；流動相：甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表 1）。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.6 方法學考察

精密度試驗：取同一供試品溶液，精密稱定，連續(xù)進樣6次。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD為0.31%（n＝6），相對峰面積的RSD為 2.36% （n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品粉末共6份，每份約1 g，按2.1項下方法制備供試品溶液，分別進樣。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD為0.80%（n＝6），相對峰面積的RSD為3.67%（n＝6）。表明該方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h時進樣測定。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD為 0.24% （n＝5），相對峰面積的RSD為 2.95%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 對照指紋圖譜的建立

分別稱取烏梅不同炮制品樣品，按2.4項下方法制備供試品溶液。取各供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄65 min的色譜圖，導出烏梅不同炮制品色譜圖的AIA格式文件，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）進行分析。

2.8 高效液相色譜（HPLC）特征圖譜相似度分析

用中位數(shù)法建立對照指紋圖譜，并進行多點校正及色譜峰的匹配，共標定25個共有峰，各樣品選定共有峰的峰面積總和均大于50%，相對保留時間的RSD均小于1%。根據(jù)相似度評價結(jié)果，烏梅、醋烏梅、醋蒸制烏梅與對照指紋圖譜的相似度均較高；烏梅炭與對照指紋圖譜的相似度均較低。結(jié)果見圖1，表2和表3。

圖1 烏梅不同炮制品高效液相色譜特征指紋圖譜及共有模式

表2 烏梅及不同炮制品共有峰峰面積及相對峰面積

表3 烏梅及不同炮制品HPLC特征指紋圖譜相似度評價結(jié)果

2.9 主成分分析

以烏梅不同炮制品的HPLC特征指紋圖譜共有峰的峰面積為變量，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對原始數(shù)據(jù)作標準化處理后進行主成分分析。以主成分的特征值及貢獻率為依據(jù)選擇主成分，結(jié)果見表4。前3個主成分特征值均大于1，累計貢獻率為92.468%，包含了大部分的信息。其中，主成分1的特征向量載荷較高且符號為正的共有峰相對保留時間（tR）分別為 5.252，6.579，10.542，16.831，22.910，47.367 min；主成分 2 的特征向量載荷較高且符號為正的共有峰的tR分別為5.053，5.629，9.608，22.910，50.961 min；主成分 3 的特征向量載荷較高且符號為正的共有峰tR分別為12.508，54.176，54.875 min。詳見圖 2。

表4 主成分特征值及貢獻率

圖2 三維載荷圖

以各樣品在主成分1、主成分2、主成分3中的得分繪制 3D 得分圖。由圖 3 可知，樣品 S1，S2，S4，S5，S6 距離較近，可分為一類。樣品S3可分為一類，主成分分析結(jié)果與相似度分析結(jié)果基本一致，進一步驗證了相似度分析的可靠性。

圖3 主成分3D得分圖

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

為得到峰形，分離度較好，色譜信息較豐富的HPLC指紋圖譜，本試驗中對乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、甲醇-水、甲酸-磷酸溶液等不同流動相組成及流動相比例進行了梯度洗脫考察。并考察了不同測定波長215，288，314 nm對測定結(jié)果的影響。結(jié)果以 Phenomenex C18柱作為色譜柱，檢測波長為215 nm，流速為0.6 mL ／min，柱溫為 25 ℃ ，流動相為甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）梯度洗脫為能得到較好指紋圖譜信息。

3.2 相似度評價與主成分分析

相似度評價結(jié)果顯示，烏梅及醋炮制烏梅與對照指紋圖譜之間的相似度較高，均在0.950以上，烏梅炭與對照指紋圖譜的相似度較低。通過繪制主成分1、主成分2、主成分3的3D得分圖，烏梅與醋烏梅在3D散點圖中的空間距離較近，可劃分為一類，而烏梅炭與烏梅及醋烏梅相距較遠，分為一類。相似度的評價結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致，表明炒炭過程造成烏梅化學成分的變化較大。

3.3 指紋圖譜對烏梅及炮制品質(zhì)量評價的意義

中藥炮制后可達到增強療效，降低毒副作用，改變或緩和藥性，引藥歸經(jīng)等作用。醋制可引藥入肝經(jīng)，并有引藥入血及收斂等作用。由于烏梅醋制研究現(xiàn)狀的薄弱，臨床用藥時往往與炭炒發(fā)生混用。烏梅不同炮制品指紋圖譜結(jié)果顯示，烏梅及醋烏梅指紋圖譜信息既有共性又有差異，化學成分種類基本一致，但峰面積有所不同。烏梅炭與烏梅及醋烏梅化學成分及含量都有較大差異。本研究中通過指紋圖譜與化學識別模式相結(jié)合的方式評價烏梅及不同炮制品的質(zhì)量，可為其藥理作用的差異進一步研究及臨床用藥提供一定的依據(jù)。